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目的:调控血管平滑肌(VSMC)表型转换是防治PCI术后再狭窄的新策略,micro RNA作为VSMC表型转换的调节因子,可通过转录后水平调控下游靶基因的的表达从而影响VSMC的表型转换。本组首先克隆的C2H2型锌指核转录因子ZFP580可调控内皮细胞及VSMC的增殖及迁移而影响血管重塑。本组新近实验证明:micro RNA-206既可靶向调控ZFP580的表达,又可促进VSMC从收缩型向合成型转换。本实验拟采用micro RNA-up与micro RNA-down技术,观察micro RNA-206表达水平的变化对大鼠VSMC分化功能的影响,并验证其可能的分子机制。方法:提取分离大鼠VSMC,通过形态学观察及免疫组化法进行鉴定。生物信息学分析ZFP580与mi R-206的结合位点。利用TGF-β(根据文献参考选取2ng/ml)对大鼠VSMC进行不同时间点刺激,对照组选用等量的DMEM。Realtime-PCR测定mi R-206的表达水平;Western-blot检测ZFP580、SMa-actin、SM22a、Smad2/3、phospho-Smad2/3的表达水平;使用慢病毒过表达或低表达mi R-206、慢病毒过表达或低表达ZFP580和应用SB431542抑制剂后检测相关指标;荧光素酶报告实验(Luciferase)检测mi R-206与ZFP580 3‘UTR的结合作用。结果:(1)在大鼠VSMC加入适宜的TGF-β(根据文献参考选取2ng/ml)进行预处理,分别刺激大鼠VSMC 6h、12h、24h、48h,对照组中加入等量的DMEM。利用Realtime-PCR测定mi R-206的表达水平,结果发现在12h的时候mi R-206的水平降至最低点,与对照组相比具有统计学差异(P<0.05)。Western-blot检测ZFP580的表达水平,结果显示同样在12h时ZFP580的表达水平达到最高,与对照组相比具有统计学差异(P<0.05)。故在随后的实验当中,时间节点选取12h作为实验刺激最佳时间点。(2)SMa-actin、SM22a、Smad2/3、phospho-Smad2/3的表达水平:利用TGF-β(2ng/ml)刺激VSMC不同时间点均导致phospho-Smad2/3的升高,随着刺激时间的延长呈现着表达减少的趋势。而Smad2/3的表达各组间无明显差异。TGF-β可诱导大鼠VSMC由合成表型向收缩表型的转换,促进VSMC的分化,在实验当中随着TGF-β的刺激,平滑肌细胞的分化标记物SMa-actin、SM22a与对照组相比表达显著上调(P<0.05)。(3)SB431542减少TGF-β(2ng/ml)刺激导致的ZFP580、SMa-actin、SM22a表达水平的升高:选取20μM的SB431542对VSMC进行预处理,2h后加入TGF-β(2ng/ml)刺激VSMC12h,对照组加入等量DMSO预处理细胞余处理相同,以空白对照组为参照。从结果当中发现,在预先加入SB431542之后明显降低了TGF-β(2ng/ml)诱导ZFP580的表达上调(P<0.05),phospho-Smad2/3的表达水平较对照组明显降低(P<0.05)。与此同时,Western-blot检测SMa-actin、SM22a的表达水平结果显示:SMa-actin、SM22a的表达较对照组相比均不同程度的降低(P<0.05)。(4)SB431542减少TGF-β(2ng/ml)刺激导致的mi R-206水平的下调:选取20μM的SB431542对VSMC进行预处理,2h后加入TGF-β(2ng/ml)刺激VSMC12h,随后利用Realtime-PCR测定mi R-206的表达水平,结果显示mi R-206的表达水平较对照组上调了大约2.5倍(P<0.05)。(5)慢病毒过表达mi R-206:携带mi R-206基因慢病毒载体按10 MOI感染大鼠VSMC 72小时后,在倒置荧光显微镜488nm激发光下观察绿色荧光产生情况,细胞转染效率可达到80%以上,Realtime-PCR检测VSMC中mi R-206的基因表达水平。结果显示Lv-GFP组与对照组相比没有明显差异(P<0.05),Lv-rno-mi R-206转染组与对照组组相比,mi R-206的基因表达水平显著增高(P<0.05)。在慢病毒转染后,加入TGF-β(2ng/ml)刺激VSMC12h,对照组选取正常的VSMC加入等量的TGF-β(2ng/ml)。在随后的结果中发现:Western-blot检测SMa-actin、SM22a的表达水平对比对照组显著降低(P<0.05)。而mi R-206的基因表达水平较对照组降低(P<0.05)。(6)过表达或低表达mi R-206慢病毒感染大鼠VSMC72h后,。Western-blot检测ZFP580的表达水平,结果显示:Lv-rno-mi R-206感染组与对照组相比,ZFP580的表达水平下调(P<0.05),mi R-206低表达感染组与对照组相比,ZFP580的表达水平显著上升(P<0.05)。(7)过表达或低表达ZFP580慢病毒感染大鼠VSMC72h后。Western-blot检测ZFP580的表达水平,结果显示:高表达ZFP580感染组与对照组相比,SMa-actin与SM22a的表达水平上调(P<0.05),低表达ZFP580感染组与对照组相比,SMa-actin、SM22a的表达水平显著上升(P<0.05)。(8)荧光素酶报告实验(Luciferase)对mi R-206与ZFP580进行外源性验证:克隆ZFP580的3’UTR区域,构建到荧光素酶报告基因载体p GL-3M中。293细胞转染mi R-206过表达及对照病毒,随后将报告基因载体和内参质粒p RL-CMV在脂质体lipofectin 2000介导下共转染细胞转染mi R-206过表达的293细胞。48h后,检测Luciferase活性,结果显示:mi R-206过表达组p GL-3M的报告活性显著降低,提示mi R-206可与ZFP580的3’UTR区域结合。结论:TGF-β可以促进平滑肌细胞由合成型向收缩型转换,并且上调VSMC分化标记物SMa-actin、SM22a的表达水平,TGF-β通过经典的Smad2/3通路调控micro RNA-206与ZFP580的表达,过表达mi R-206可以造成SMa-actin、SM22a及ZFP580的表达降低,抑制平滑肌细胞的分化。