阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种进行性发展的神经退行性疾病,是当代社会中老年人口中最常见的痴呆形式。AD的神经病理学特征包括由淀粉样蛋白(Aβ)形成的细胞外斑块、过度磷酸化微管相关蛋白(tau)积累形成的细胞内神经纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFT)和广泛的神经元丢失。长久以来,“淀粉样蛋白级联假说”认为Aβ肽的异常积累是AD发病的关键。然而,迄今为止,集中于减少Aβ沉积的Aβ免疫疗法均未产生临床上有意义的结果。因此,单纯通过消除Aβ病理学不足以达到治愈AD的效果,而开发靶向tau病理学的治疗手段也成为了一种非常有潜力的治疗策略之一。Tau蛋白是哺乳动物神经系统中的一种主要的微管相关蛋白(由microtubule-associated protein(MAPT)基因编码),在生理条件下调节微管的组装和稳定性以及轴突运输。然而,在病理生理条件下,在AD和相关的病理性疾病(包括皮质基底变性(CBD),进行性核上麻痹(PSP),Pick病(PD)和额颞叶痴呆(FTLD))中,大量毒性表位的tau出现了异常高水平的磷酸化,如Ser202、Thr205、Ser238、Ser404等。MATP基因编码缺陷和tau蛋白过度磷酸化引起的疾病统称为tau蛋白病。迄今为止,散发性tau病中tau蛋白过度磷酸化的主要原因仍不确定。在家族性tau蛋白病患者中,已经鉴定出的包括G272V,P301L,P301S,V337M和R406W在内的遗传突变,易使tau蛋白过度磷酸化,从而损害了tau促进微管组装的能力。这些突变促进tau的聚集,形成成对的螺旋丝(PHF)和神经原纤维缠结(NFT)。为了研究tau病理在体内的病理过程和开发基于tau病理的药物,科学家们开发了一系列表达人突变tau基因的模型动物。这些tau转基因小鼠模型具有一些重要的AD病理特征,包括突触病理学、NFT形成和神经元丢失,已经成为探索tau功能障碍的机制和开发神经退行性疾病疗法的重要工具。其中TauP301S(PS19系)就是一种被广泛使用的阿尔茨海默tau病理小鼠模型。P301S转基因小鼠脑内人源tau蛋白表达水平比内源性tau小鼠高约5倍,从而导致P301S小鼠在脑内快速产生较为严重的tau病。P301S转基因小鼠在6月龄时产生tau纤维并逐渐发育,其在9-12月龄是逐渐富集并伴有明显的神经元死亡和脑萎缩。除此之外,tau转基因小鼠也存在肌肉萎缩和运动功能失调等行为学异常。然而,虽然目前P301S小鼠被广泛应用于AD药物的临床前评价中,普遍采用行为学和病理学等实验对药物的有效性进行评价,但对该小鼠模型的行为学、病理学、血清学等指标随年龄变化的趋势以及他们之间的关系知之甚少。另外,在老年痴呆疾病的流行病学研究中发现,男性和女性人群的AD发病率、发病症状、生存期等方面存在明显差异,但性别差异在以P301S小鼠为模型的药物研究中并未受到关注。在本研究中,我们首先系统地考察了不同性别和年龄的Tau P301S转基因小鼠在行为学、tau病理学、以及血浆和脑生物标志物方面的差异,并探究了tau蛋白病进程中这些因素之间的相关性,也筛选到了一些可以指示P301S小鼠tau病理发展的潜在的生物标记物指标。结果表明,与野生型同窝小鼠相比,雄性P301S转基因小鼠在体重、存活率、后肢夹紧评分、脊柱后凸评分、复合表型评分总分、筑巢能力、脑中pTau(S202/T205)和胶质细胞水平方面表现出显着变化。相比之下,雌性P301S转基因小鼠仅对水迷宫实验和实验开放旷场实验敏感。此外,我们发现了血浆中巨噬细胞炎症蛋白(MIP-3α)缺乏和干扰素(IFN-γ)、白介素-5(IL-5)、IL-6上调,这些因子可以作为潜在的AD生物标志物。目前靶向磷酸化tau的主动免疫疗法是新型的AD治疗方法。然而现在处于临床前或临床阶段的Tau表位疫苗最多携带两个磷酸化位点,治疗效果有限。主动疫苗如何在体内维持高水平、长时程的抗体也有待探究。另外,疫苗的作用机制也未得到深入研讨。为解决这些问题,我们研发了一种以诺如病毒P颗粒为载体的靶向磷酸化tau病理位点的主动疫苗,并在P301S小鼠中进行免疫原性、安全性和有效性的评估。为了筛选出最优的tau疫苗的磷酸化表位,我们对AD患者中最易出现高度磷酸化tau位点的附近的截短的多肽进行组合,并筛选出了具有Ser202、Thr205、Ser396、Ser404磷酸化靶点的pTau31多肽抗原表位,该多肽可在在体内诱导产生针对四种磷酸化表位的特异性抗体,且不会产生针对磷酸化和非磷酸化tau蛋白的T细胞免疫反应。随后,我们将合成的pTau31多肽通过半胱氨酸/空气氧化法偶联到诺如病毒P颗粒蛋白载体上,成功获得以诺如病毒P颗粒为载体的磷酸化tau表位疫苗,PP-pTau31。我们在几种候选佐剂中筛选了能引起高抗体水平的、诱导的抗体持续时间长且无T细胞免疫反应风险的CpG和AS02佐剂组合用于主动疫苗的免疫。我们在P301S转基因小鼠中对PP-pTau31疫苗的免疫原性、安全性和有效性等方面进行考察。结果显示,PP-pTau31疫苗可成功降低P301S小鼠脑内磷酸化tau蓄积、降低脑内胶质细胞增生、缓解tau相关的运动功能障碍及改善认知水平,且不会诱发针对磷酸化和非磷酸化tau的T细胞免疫反应、无体内炎症因子和趋化因子异常,无脏器毒性。另外,我们还对PP-pTau31疫苗诱导的抗体的作用机制进行了探讨。结果表明,pTau31特异性抗体可能通过多种途径降低tau病理的影响:(1)血液中抗体通过结合血中游离的pTau造成血/脑中pTau浓度差,促进脑内病理tau蛋白外排入血,从而降低脑中磷酸化tau蛋白含量;(2)部分血液中的抗体跨越血脑屏障,结合脑中游离的病理tau蛋白,抑制其对神经元的毒性作用;(3)部分血液中的抗体跨越血脑屏障,与脑中的NFT结合形成抗体-抗原复合物,使其降解从而降低tau病理。综上,我们成功完成对TauP301S转基因鼠的行为学、病理学、血清学等方面的研究,掌握了各指标与发病进程的相关性,并发现了MIP-3α等潜在的生物标志物。在此基础上,我们也完成了一种以诺如病毒P颗粒为载体的Tau表位疫苗的开发,PP-pTau31。结果表明该疫苗可在TauP301S模型小鼠中产生高水平、长时间存在的pTau特异性抗体,在行为学、病理学等方面降低发病特征,并无T细胞免疫反应、细胞因子异常及脏器损伤等安全风险。