【摘 要】
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目的:T-2毒素是镰刀菌产生的A型单端孢霉烯毒素之一,对神经系统有严重损害作用。近年来研究提示,T-2毒素诱导的神经毒性与氧化应激和线粒体损伤密切相关,但其具体毒作用机制尚不清楚。NFE2L2作为细胞内调控抗氧化应激的关键转录因子,在诱导机体抗氧化应答中起着重要作用,PGC-1α介导的线粒体生物合成（简称“线粒体生成”）是调节线粒体功能、对抗毒性损伤的重要机制。基于人源细胞的体外试验已成为外源性化
【基金项目】
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国家重点研发计划项目课题,2018YFC1602602,基于共性致解毒机制的未知剧高毒化学危害快速发现及通量筛查关键技术研究；
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目的:T-2毒素是镰刀菌产生的A型单端孢霉烯毒素之一,对神经系统有严重损害作用。近年来研究提示,T-2毒素诱导的神经毒性与氧化应激和线粒体损伤密切相关,但其具体毒作用机制尚不清楚。NFE2L2作为细胞内调控抗氧化应激的关键转录因子,在诱导机体抗氧化应答中起着重要作用,PGC-1α介导的线粒体生物合成（简称“线粒体生成”）是调节线粒体功能、对抗毒性损伤的重要机制。基于人源细胞的体外试验已成为外源性化合物毒性测试的重要发展方向,是21世纪毒性测试的核心策略。本研究旨在以人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y为神经细胞模型通过体外试验从线粒体生成和氧化应激调节角度探讨NFE2L2/PGC-1α信号通路在T-2毒素致人神经细胞毒性损伤中的作用。研究方法:1.选用人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y作为研究模型,利用CCK-8试剂盒和LDH试剂盒检测细胞存活率及乳酸脱氢酶（LDH）漏出率,以评价T-2毒素诱导的神经细胞毒性特征;通过高内涵成像分析检测T-2毒素对细胞活性氧自由基（ROS）及线粒体膜电位（MMP）的影响、荧光素酶法检测细胞ATP含量、谷胱甘肽检测试剂盒测定细胞内GSH/GSSG水平,以及利用RT-PCR技术测定细胞mt DNA拷贝数,以观察线粒体损伤及功能影响;同时应用RT-PCR技术和Western Blot技术检测NFE2L2/PGC-1α通路相关基因和蛋白的表达情况。2.应用瞬时转染技术敲降NFE2L2,建立NFE2L2敲降（NRF2-KD）的SH-SY5Y细胞模型,并利用RT-PCR技术验证其敲降效率。3.对阴性对照（Negative Control,NC）和NFE2L2敲降的SH-SY5Y细胞进行T-2毒素处理后利用CCK-8试剂盒和LDH试剂盒检测细胞活力,并检测ROS、MMP、ATP、GSH/GSSG以及mt DNA的变化;并利用RT-PCR技术和Western Blot技术对NC和NRF2-KD的SH-SY5Y细胞中NFE2L2/PGC-1α通路相关基因和蛋白的表达情况进行定量分析,探讨毒性效应改变和其潜在的分子调控机制。结果:1.T-2毒素处理SH-SY5Y细胞24小时后,与对照组相比,T-2毒素可浓度依赖性引起细胞存活率下降和LDH漏出,引发细胞毒性效应。2.高内涵成像分析结果表明,T-2毒素处理6小时可显著增加细胞内ROS水平,并引起细胞MMP丧失,ATP含量、GSH/GSSG和mt DNA水平明显降低。3.Western Blot检测结果提示,T-2毒素处理6小时可显著上调NFE2L2及其下游相关蛋白NQO1、HO-1和SOD2的表达,并下调PGC-1α、SIRT1及其下游相关蛋白NRF1和TFAM的表达。类似地,RT-PCR检测结果提示,T-2毒素可显著上调NFE2L2及其下游抗氧化基因NQO1、SOD2、HO-1、GCLC、GCLM等的表达,并下调PGC-1α、SIRT1及其下游相关基因NRF1、TFAM和UCP2的表达。4.T-2毒素暴露后,与阴性对照细胞相比,NFE2L2敲降细胞活力及MMP显著降低,ROS生成显著增加,氧化应激水平和线粒体损伤加剧,同时RT-PCR和Western Blot结果提示NFE2L2敲降细胞内NFE2L2/PGC-1α抗氧化和线粒体生成通路受到显著抑制。结论:1.T-2毒素可诱导SH-SY5Y细胞ROS生成增加,引起氧化应激与线粒体功能紊乱,最终引起细胞死亡。2.NFE2L2敲降会加剧T-2毒素诱导的氧化损伤和线粒体功能障碍。3.T-2毒素可激活NFE2L2信号通路,诱导细胞产生适应性抗氧化反应,但PGC-1α介导的线粒体生物合成对T-2毒素更为敏感。NFE2L2/PGC-1α介导的抗氧化防御和线粒体生成功能调节在T-2毒素致神经细胞损伤中发挥重要作用。
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