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白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)是对虾和其它水产甲壳类动物的重要病原体,该病毒传染能力强、致死率极高,给全球不同虾类养殖业造成巨大经济损失。到目前为止鉴于缺少可用于WSSV感染增殖的对虾细胞系,我们对于WSSV致病机理的很多科学问题仍知之甚少。 最近建立培养的螯虾造血组织(Hematopoietic tissue,Hpt)细胞是一种研究WSSV感染的理想细胞,本研究以红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)Hpt细胞为研究模型,利用细胞免疫荧光、RNA干扰、抗体转染和重组表达蛋白功能鉴定等技术探究了红螯螯虾伽马氨基丁酸受体相关蛋白(γ-aminobutyric acidreceptor-associated protein,Cq-GABARAP)在WSSV感染中的重要作用,并初步探讨了Cq-GABARAP是否通过自噬调节PI3K-Akt信号通路及Rac1信号通路影响WSSV入胞。取得成果具体如下: 1.使用亚细胞蛋白质组抽提试剂盒及细胞免疫荧光的方法对Cq-GABARAP蛋白进行了亚细胞定位并发现在WSSV感染早期Cq-GABARAP与WSSV存在共定位;通过RNA干扰和抗体转染技术敲降或封阻Cq-GABARAP蛋白后发现WSSV入胞减少,证明Cq-GABARAP参与WSSV入胞感染;添加重组表达的Cq-GABARAP蛋白后WSSV入胞增多,但抑制了病毒早期的转录复制,说明Cq-GABARAP可能在WSSV感染细胞的不同时期发挥多功能作用。 2.为阐明Cq-GABARAP是否依赖于自噬调节PI3K-Akt信号通路影响WSSV入胞,我们首先基因克隆获得红螯螯虾Cq-PI3Kcα、Cq-PI3Kcδ和Cq-Akt基因序列:Cq-PI3Kcα完整开放阅读框(Open reading frame,ORF)为3138 bp,编码1045个氨基酸残基;Cq-PI3Kcδ完整ORF为3192 bp,编码1072个氨基酸残基;Cq-Akt完整ORF为1557 bp,编码518个氨基酸残基。使用化学抑制剂LY294002抑制Cq-PI3K蛋白活性或使用Akt inhibitor抑制Cq-Akt蛋白活性后发现WSSV入胞增多,但Cq-GABARAP蛋白含量没有发生变化,结果提示PI3K-Akt信号通路参与WSSV入胞调控,但与Cq-GABARAP无关。 3.为解析Cq-GABARAP是否通过调节细胞内吞活性来影响WSSV入胞,我们克隆获得了GABARAP调控内吞下游信号通路中的红螯螯虾Rac1(Cq-Rac1)基因(GenBank登录号:KP765446)。Cq-Rac1完整ORF为588 bp,编码195个氨基酸残基,具有保守的RHO结构域。使用化学抑制剂和RNA干扰技术抑制或敲降Cq-Rac1蛋白活性后WSSV入胞增多,且转染重组表达的Cq-Rac1蛋白后WSSV入胞显著减少,说明Cq-Rac1负调控WSSV入胞。此外RNA干扰敲降Cq-Rac1可进一步增强Cq-GABARAP介导的WSSV入胞促进作用,表明Cq-GABARAP可能通过调控Cq-Rac1活性来影响WSSV入胞。 综上,本研究发现Cq-GABARAP蛋白影响WSSV入胞感染过程,并可能通过GABARAP-Rac1信号通路来实现;同时本研究发现PI3K-Akt信号通路也影响WSSV入胞,但其具体作用机制仍需进一步探究。