胃癌(gastric cancer)是常见的恶性肿瘤之一。该病发病隐匿,早期不易被发现,当出现临床症状时大部分已处于进展期,化疗在进展期胃癌的治疗中占有重要地位。5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)及其衍生物是临床上常用的治疗进展期胃癌的化疗药物,通过抑制胸苷酸合酶发挥作用。然而在临床上应用5-FU一段时间后胃癌细胞会对其敏感性降低,同时对其它种类的胃癌化疗药物也产生了不同程度的耐药性,即多药耐药(Multidrug-resistance,MDR)。因此研究5-FU诱导的耐药机制为逆转胃癌细胞的多药耐药提供理论依据。在体外建立多药耐药细胞系是研究MDR的重要手段。鉴于目前国内外尚缺乏5-FU诱导的人胃癌BGC823细胞多药耐药模型,本文在前期建立的5-FU诱导的多药耐药细胞株BGC823/5-FU的基础上,从经典耐药途径P-gp、细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3和Survivin方面对该细胞株的耐药机制进行了初步研究,为寻找逆转胃癌多药耐药的新方法提供了理论依据。蛋白质组学作为后基因组学时代研究的一个重要内容,已广泛深入到生命科学和医药学的各个领域,其理论和技术的发展完善为肿瘤多药耐药研究带来了新的思维方式,它可以从蛋白质整体水平这一全新角度来研究肿瘤细胞多药耐药机制,有助于发掘出新的多药耐药相关分子。本实验运用固相pH梯度双向电泳技术成功构建了胃癌细胞BGC823和5-FU诱导的多药耐药细胞BGC823/5-FU的双向电泳图谱,并比较了两者之间的差异,以期发现新的与胃癌多药耐药相关的蛋白质分子,为进一步研究胃癌多药耐药机制奠定基础。主要研究内容和主要结果如下:一、人胃癌多药耐药细胞系BGC823/5-FU耐药机制的初步研究前期研究中,我们采用反复大剂量冲击结合逐步递增药物浓度法建立了国人低分化胃腺癌耐药细胞株BGC823/5-FU。本研究应用荧光倒置显微镜观察BGC823/5-FU的形态,结果发现BGC823/5-FU细胞较BGC823细胞胞体略增大,胞核增大,形状更为不规则,并可见散在的多核瘤巨细胞。流式细胞仪检测BGC823/5-FU细胞表面P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的表达和细胞内柔红霉素浓度,结果表明,BGC823/5-FU细胞P-gp的表达较其亲本细胞BGC823显著上升,细胞蓄积DNR的能力却明显下降;应用RT-PCR法检测细胞mdrl的表达,结果发现BGC823/5-FU细胞mdrl的表达较BGC823升高。以上结果表明,P-gp参与了BGC823/5-FU细胞多药耐药的产生。运用Western-blot法检测了凋亡相关蛋白的表达,结果发现BGC823/5-FU细胞Bax和Caspase-3的表达较BGC823细胞显著下调,Bcl-2和Survivin的表达明显上调。这些结果表明,Survivin、Bcl-2、Bax和Caspase-3参与了胃癌细胞BGC823/5-FU多药耐药性的形成,对这些分子的研究有助于揭示胃癌细胞多药耐药的机制,可为研发与这些基因或蛋白相关的药物提供依据。二、胃癌细胞及其多药耐药细胞蛋白质分子的差异展示化学裂解方法提取胃癌细胞BGC823和5-氟尿嘧啶诱导的耐药细胞BGC823/5-FU总蛋白质,Bradford法测定蛋白质浓度,运用固相pH梯度双向凝胶电泳技术成功构建了胃癌细胞BGC823和5-氟尿嘧啶诱导的耐药细胞BGC823/5-FU的双向电泳图谱,ImagingMaster 2D Melanie 5.0图像分析软件进行比较分析,识别差异表达的蛋白质。结果显示,在胃癌细胞BGC823凝胶图谱上可识别(1282±36)个蛋白点,在耐药细胞BGC823/5-FU凝胶图谱上可识别(1305±29)个蛋白点。其中27个点仅在耐药细胞中高表达,但在敏感细胞中未出现,5个蛋白点仅在敏感细胞中高表达,但在耐药细胞中未出现。耐药细胞蛋白质表达量为敏感细胞2-5倍的蛋白点为33个,敏感细胞蛋白表达量为耐药细胞2-5倍的蛋白点为17个。结果表明,双向电泳可以有效分离、展示胃癌细胞BGC823及其5-氟尿嘧啶耐药细胞BGC823/5-FU的蛋白质。其差异表达蛋白点的质谱分析正在进行中,以期为进一步阐明胃癌MDR机制提供理论依据。