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氯化两面针碱(nitidine chloride)属于苯菲啶型生物碱,为黄治勋等[1]从芸香科花椒属(Zanthoxylum nitidum (Roxb. )DC.)植物两面针的干燥根提取的一种生物碱。已有的研究主要是抗炎、镇痛、解痉等,关于抗肿瘤疗效也有相关报道,如氯化两面针碱对慢性细胞型白血病有较好的临床疗效。而对肝癌的治疗还在实验研究阶段,目前国内外报道很少。我们从体外一方面研究氯化两面针碱抗肝癌作用及机理;另一方面观察其对人正常胚肝细胞、人正常胚肾细胞增殖抑制作用影响,结合小鼠的急性毒性实验,评价其用药安全性。目的:1通过体外实验考察氯化两面针碱体外抗肝癌细胞作用并探讨其作用机制。2通过体外氯化两面针碱对正常肝肾细胞增殖抑制实验和小鼠的急性毒性实验,考察氯化两面针碱用药安全性。方法:1应用MTT法研究体外氯化两面针碱对人肝癌细胞株SMMC-7721细胞生长的影响。2应用Hoechst荧光染色法及Annexin V-FITC/PI双染法等方法研究氯化两面针碱对人肝癌细胞株SMMC-7721细胞凋亡及细胞周期的影响。3应用免疫组化法研究氯化两面针碱对SMMC-7721细胞中bcl-2,bax,P53的蛋白表达;透射电镜观察肿瘤细胞超微结构。4通过酶解可见光底物DEVD-pNp测定Caspase-3酶活性。5采用MTT法检测对人胚肝细胞L-02、人胚肾细胞293的增殖抑制作用;检测用药前后L-02、293细胞超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、乳酸脱氢酶(LDH)的含量变化。6通过小鼠尾静脉单次注射氯化两面针碱,观察所产生的毒性反应并测定其半数致死量,评价其急性毒性。结果:1在(0.8-12.8)μg/mL的浓度范围内氯化两面针碱对人肿瘤细胞株均有不同程度的增殖抑制作用。氯化两面针碱对人肿瘤细胞株SMMC-7721均表现明显的细胞毒作用并呈剂量依赖关系。2各剂量组(0、2、4、8)μg/mL对细胞周期的影响表现为G2/M期阻滞,作用SMMC-7721 24h后的凋亡指数分别为(18.9±0.23)%、(23.3±1.54)%、(28.3±3.83)%,明显高于对照组(2.0±0.06)%,提示氯化两面针碱抑制肿瘤细胞增殖可能与细胞周期阻滞和诱导细胞凋亡有关。3免疫组织化学方法检测结果显示:加药组肿瘤细胞中bcl-2、bax和P53均有不同程度的表达,氯化两面针碱组bcl-2表达较对照组组弱,bax表达较强,而P53的蛋白表达也有显著差异(p<0.01)。电镜下可见氯化两面针碱给药组肿瘤细胞核染色质浓缩并边缘化,核碎裂,胞浆空泡化明显,出现凋亡小体。4氯化两面针碱在体外对人正常胚肝细胞L-02,人正常胚肾细胞293的增殖也有一定的抑制作用,且随药物剂量的增大,抑制率亦相应增大。5氯化两面针碱尾静脉单次给药的LD50值为其LD50为19.999 mg/kg,LD50的95%平均可信限为(19.999±2.696 )mg/kg,LD50的99%平均可信限为(19.999±3.534)mg/kg。结论:氯化两面针碱体外明显抑制SMMC-7721细胞增殖,其抗肿瘤作用的机理可能是:(1)直接抑制肿瘤细胞的生长;(2)调控肿瘤细胞生长相关基因的蛋白表达;(3)阻滞细胞于G2/M期并诱导肿瘤细胞凋亡。并通过体内外测试氯化两面针碱毒理学安全性,显示在有效剂量范围内,氯化两面针碱对正常人肝肾细胞,小鼠全身毒性较小。