阿片类药物是最常用镇痛药物,广泛应用于临床,作为术前用药、麻醉辅助用药、复合全麻的主药,以及用于术后镇痛和慢性疼痛治疗等,具有很好的镇痛疗效。近20年来研究发现,应用阿片类药物,出现急性耐受及痛觉过敏现象。所谓阿片类药物急性耐受(Acute tolerance)是指使用阿片类药物后,镇痛作用逐渐减退以致消失,或如要得到同样的镇痛效果需逐渐增加阿片类药物的剂量。阿片类药物痛觉过敏(Opioid-induced hyperalgesia, OIH)是指应用阿片类药物在治疗疼痛时,导致病人对疼痛更加敏感,或已存在的疼痛加重。急性耐受及OIH发生机制尚未完全明了,目前所知主要有：①中枢谷氨酰肽系统的活化,主要通过与阿片肽能和脑啡肽能系统稳态配对的N-甲基-D-天(门)冬氨酸(NMDA)受体发挥作用；②脊髓释放可引发痛觉过敏的物质—强啡肽；③脊髓下行易化的作用,主要通过位于延髓头端腹内侧的阿片敏感性“兴奋型”细胞调节。目前,研究最多的为NMDA受体的激活在痛觉过敏的产生和维持中的作用。瑞芬太尼是一种人工合成的新型超短效阿片类药物,具有起效快、作用时间短、消除迅速、连续输注无蓄积以及代谢不依赖于肝肾功能的特点,其消除不受年龄、性别、体重的影响,适用于多种病人的全身麻醉、术后镇痛和分娩镇痛,被誉为21世纪的阿片类镇痛药。近年来研究发现,瑞芬太尼可诱发术后痛觉敏化,使用不当可加重术后疼痛,不利于患者的恢复。对于瑞芬太尼的急性耐受及停药后痛觉过敏现象,目前机理尚不清楚。随着瑞芬太尼临床使用范围的扩大,瑞芬太尼导致痛觉敏化等不良反应的临床特点及防治策略迫切需要了解。研究证实瑞芬太尼术后痛敏与脊髓背角神经元敏感化有关,中枢敏感化是主要原因。这些神经元均含阿片类μ受体,瑞芬太尼作用于μ受体后通过激活蛋白激酶C而活化NMDA受体,瑞芬太尼也可直接激活NMDA受体；NMDA受体通道开放后通过一氧化氮合酶(NOS)可促进大量NO产生, NO又促进NMDA受体的活性,形成正反馈,从而提高神经元的兴奋性,使疼痛中枢敏感化,伤害性刺激信号传入增加,导致痛觉过敏。氯胺酮为非竞争性NMDA受体拮抗剂。研究证明小剂量氯胺酮鞘内单独注射对痛觉阈值无影响,但可抑制或翻转吗啡耐受,防治术后痛觉过敏的发生。氯胺酮因容易引起感觉和认知的异常以及幻觉的发生,并未广泛用于术后镇痛,但近年来提倡的小剂量(<1 mg·kg-1静脉)应用可避免这些缺点。阿片类药物急性耐受及停药后痛觉过敏的影响因素很多,如实验对象、给药方式、持续时间、输注方式等；以往的研究主要针对志愿者或临床手术,由于伦理学的原因,评价痛觉的指标、给药的剂量和输注速度受到很大限制。大量输注短效阿片类药物(芬太尼或是阿芬太尼)可产生急性阿片类药物耐受,停药后引起OIH。但瑞芬太尼是否引起急性耐受及OIH尚存在争议,小剂量氯胺酮用以预防瑞芬太尼OIH的相关研究甚少,发生机制亦尚不清楚。本研究采用成年雄性SD大鼠,持续静脉输注不同剂量瑞芬太尼4 h,观察痛觉阈值的变化、与剂量是否呈相关性以及停药后是否出现痛觉过敏现象,并进一步明确NMDA受体在瑞芬太尼产生停药后痛觉过敏现象中的作用,探讨鞘内注射小剂量氯胺酮对瑞芬太尼停药后痛觉过敏现象的影响,从而为瑞芬太尼停药后痛觉过敏的临床研究及其预防提供参考。统计学处理方法采用SPSS统计学软件(13.0版本)进行统计处理,计量资料以均数±标准差(x±s)表示。各组实验动物平均体质量,机械性和热痛阂基础值采用单因素方差分析(one-way ANOVA),置管前后痛阈值采用配对t检验,同一时间不同组间采用单因素方差分析,组内不同时间点痛阈值采用重复测量数据的方差分析,不同时间点的组间多重比较和组内不同时间点的多重比较采用LSD法,脊髓NMDA受体阳性表达数目采用单因素方差分析,P<0.05有统计学差异。第一部分静脉持续输注不同剂量瑞芬太尼对大鼠痛觉阈值的影响目的探讨静脉持续输注不同剂量瑞芬太尼对大鼠痛觉阈值的影响,并观测痛觉阈值与剂量的关系。方法将40只健康雄性SD大鼠按瑞芬太尼剂量随机分为0.3μg·kg-1·min-1组(R1组)、0.6μg·kg-1·min-1组(R2组),1μg·kg-1·min-1组(R3组)、1.5μg·kg-1·min-1(R4组)和0.9%生理盐水0.1 ml·kg-1·min-1(N组),每组8只,建立静脉输液模型。用微量注射泵持续输注4 h,分别于静脉置管前、给药前即置管后、给予生理盐水或瑞芬太尼后1/2 h、1 h、2 h、3 h、4 h、停药后1/2 h,停药后1 h、停药后2 h、停药后24 h、停药后48 h(分别为T1-T12时点)测量大鼠的机械性痛觉阈值和热痛觉阈值,并记录。结果1.描述性统计40只大鼠全部置管成功,术后均无导管脱落,无感染,无自噬,无死亡,全部纳入统计结果。2.基本资料各组大鼠的体质量,机械性痛阈基础值,热痛阈基础值无显著性差异(P>0.05)。3.颈静脉置管前后机械性痛阈值和热痛阈值无显著性差异(P>0.05)。4.组间大鼠的机械性痛阈在持续输注过程中有显著性差异(F=4.936 P=0.000),组内时间点间有差异性显著(F=151.244 P=0.000),同一时间点不同组间存在显著性差异(F=18.361 P=0.000)；进一步进行单独效应分析,对各时点内不同组间和各组内不同时点进行LSD多重比较。组间比较：同一时间不同剂量机械性痛觉阈值存在显著性差异。T3时点,R4组高于N、R1、R2、R3组(P分别为0.000、0.000、0.000、0.002),R3组高于N、R1、R2组(P=0.000、0.003、0.002)。T4时点,各组与N组均有显著性差异,R4组高于R1、R2、R3组(P分别为0.000、0.000、P=0.028),随输注时间曲线降低。T5时点,R4组高于R1、R2组(P分别为0.002、0.000),R3组高于R1组(P=0.004)。T6时点,R4组高于R3、R1组(P分别为0.018、0.000),R3组高于R1组(P=0.012)。T7时点,R1组与R2组有显著性差异(P=0.049)。停药后,T8时点降至最低,N组与其余各组有显著性差异P<0.05, R4组与R1、R2组比较有显著性差异(P分别为0.001、0.029),R3和R1比较有显著性差异(P=0.010)。在T9,T1o时点,R4与R1、R2存在显著性差异P<0.05,之后阈值渐渐恢复至术前水平。组内比较：各组阈值在T3时达到最大值,T8时点降至最低,R3和R4组随输注时间阈值降低。R1组,输注过程中,T3、T4、T5、T6时点高于T1时点(P分别为0.028、0.049、0.025、0.040),T3-T7时点,两两比较无显著性差异,停药后T8时点低于Tl时点(P=0.031),其余时点与T1时点比较无显著性差异。R2组,输注过程中,T3-T7时点高于T1时点(P分别为0.000、0.001、0.004、0.000、0.005),且两两比较无显著性差异；停药后T8、T9时点低于T1时点(P=0.020、0.034),其余时点与T1时点比较无显著性差异。R3组,输注过程中,T3-T7时点高于T1时点(P分别为0.000、0.000、0.000、0.000、0.023),T6时点低于T3、T4时点(P分别为0.011、0.006),T7时点低于T3、T4、T5、T6时点(P分别为0.000、0.000、0.000、0.030)；停药后,T8、T9、T10时点低于T1时点(P分别为0.000、0.000、0.005)。R4组,输注过程中,T3-T7时点高于T1时点(P分别为0.000、0.000、0.000、0.000、0.000),T4时点低于T3时点(P=0.010),T5时点低于T4时点(P=0.008),T7时点低于T6时点(P=0.000),停药后,T8、T9、Tlo时点低于T1时点(P分别为0.000、0.000、0.000)。热痛阈值结果：瑞芬太尼输注过程中组间、组内比较、停药后组间比较与机械性痛阈值类似,停药后各时间点与T1时点无显著性差异。结论瑞芬太尼0.3μg·kg-1·min-1和0.6μg·kg-1·min-1剂量持续输注不出现急性耐受,1μg·kg-1·min-1和1.5μg·kg-1·min-1组剂量可在输注1h后出现耐受,且与剂量成相关性；停药后30 min出现痛觉过敏,持续至停药后2 h,OIH程度及其持续时间与剂量成相关性。第二部分鞘内注射小剂量氯胺酮对瑞芬太尼急性耐受、停药后痛觉过敏及脊髓NMDA受体表达的影响目的研究鞘内注射小剂量氯胺酮对瑞芬太尼急性耐受及停药后痛觉过敏的影响,用免疫组化方法观测其对脊髓NMDA受体表达的影响,探讨脊髓NMDA受体在瑞芬太尼停药后痛觉过敏的作用。方法24只雄性SD大鼠,随机分为N组(对照组)、R组(瑞芬太尼组)、RK组(瑞芬太尼加氯胺酮组),每组8只。N组和R组行颈静脉置管术,分别静脉输注生理盐水0.1 ml·kg-1·min-1和瑞芬太尼μg·kg-1·min-1；KR组行颈静脉和蛛网膜下腔置管术,鞘内注射氯胺酮10μg,30 min后开始输注瑞芬太尼11μg·kg-1·min-1。每组均持续输注4 h,分别于置管前、给药前即置管后、给予生理盐水或瑞芬太尼后1/2 h、1 h、2 h、3 h、4 h、停药后1/2 h、停药后1 h、停药后2 h、停药后24 h、停药后48 h(分别为T1-T12时点)测量机械性和热痛阈值,并于停药后2 h灌注,取L4/5脊髓段,用免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)技术观测各组脊髓NMDA受体的表达。结果1.描述性统计24只大鼠全部置管成功,术后均无导管脱落,无感染,无自噬,死亡,全部纳入统计结果。2.各组大鼠的体质量,机械性和热痛觉基础阈值的比较,无显著性差异(P>0.05)。3.颈静脉置管术及蛛网膜下腔置管术对大鼠机械性和热痛觉阈值的影响无显著性差异(P>0.05)。4.经重复测量数据的方差分析显示：大鼠的机械性痛觉阈值在持续输注过程中组间比较有显著性差异(F=12.396 P=0.000),时间点间比较有显著性差异(F=71.817 P=0.000),同一时间点不同组间有显著性差异(F=22.146 P=0.000),进一步进行单独效应分析,对同一时点不同组间和各组内的不同时点进行LSD多重比较。组间比较：T3-T7时点,R组和KR组机械性痛觉阈值高于N组(P<0.05),KR组与R组比较无显著性差异(P>0.101)；T4时点,R组机械性痛觉阈值达到最大值。Ts-T1o时点,R组机械性痛觉阈值低于N组(P分别为0.009、0.000、0.011),KR组与R组比较有显著性差异(P分别为0.000、0.000、0.017),KR组与R组比较无显著性差异(P>0.05)。组内比较：R组,输注过程中,T3-T7时点机械性痛觉阈值显著高于T1时点(P分别为0.000、0.000、0.000、0.000、0.014),T3时点,机械性痛觉阈值达到最大；T6时点高于T3、T4时点(P分别为0.022、0.009),T7时点高于T3、T4、T5、T6时点(P分别为0.000、0.000、0.000、0.023)；停药后T8、T9、T1o时点低于T1时点(P分别为0.000、0.000、0.000)。KR组,输注过程中,T3-T7时点机械性痛觉阂值高于T1时点(P分别为0.000、0.000、0.000、0.000、0.000),T3时点,机械性痛觉阈值达到最大；T5时点低于T3时点(P=0.040),而T5、T6、T7时点各点比较无显著性差异(P>0.05)。热痛觉阈值结果：R组瑞芬太尼输注过程中,热痛觉阈值组间、组内、停药后组间与机械性痛阈值统计结果相似,停药后各时间点热痛觉阈值与T1时点无显著性差异。KR组瑞芬太尼输注过程中,组间、组内与机械性痛阈值统计结果相似；停药后,T8时点热痛觉阈值显著高T1时点(P=0.026),其余各时点比较无显著性差异。5.三组停止输注瑞芬太尼2 h的脊髓NMDA受体表达免疫组化结果经DAB显色,显微镜下观察,细胞形状不规则,胞膜及胞浆呈棕黄色。单因素方差分析显示,NMDA受体在脊髓阳性数目的表达,R组与N组比较有显著性差异(P=0.000)；KR组与R组比较有显著差异(P=0.000),与N组比较无显著差异(P=0.112)。结论鞘内注射氯胺酮10μg可逆转瑞芬太尼急性耐受,预防其停药后的痛觉过敏；NMDA受体在瑞芬太尼停药后痛觉过敏中起重要作用。