心血管疾病（cardiovascular disease,CVD）是目前我国城市和农村居民的主要死亡原因之一。由于动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）斑块不稳定的因素导致斑块破损或者脱落而发生血管完全阻塞,容易引起相应区域的心肌发生急性缺血性坏死,并可诱发心律失常和心力衰竭,常可危及生命。目前,经皮冠状动脉支架植入和球囊扩张是治疗急性心梗的重要治疗手段。但是,动脉支架植入过程容易造成血管内膜撕裂,因此人体自发的损伤修复反应。同时,永久性的支架植入容易造成血管平滑肌细胞（smooth muscle cells,SMCs）过度增殖并造成血管内再狭窄,严重限制了其长期治疗效果。作为新兴的介入治疗技术,药物涂层球囊（drug-coated balloon,DCB）在抑制血管平滑肌增殖和急性血栓形成等方面表现出极大的优势。相比较于传统支架介入技术,药物涂层球囊的优势在于1)避免了永久性支架的植入,更好地维持血管原始动脉解剖结构和血流动力学模式;2)无多聚物载体的慢性刺激,减少慢性炎症反应的发生;3)药物在短时间内快速,均匀的分布在特定区域,而且药物浓度高,不会引起长期的炎症反应和全身不良反应。因此,药物涂层球囊正在逐渐成为未来的临床介入治疗的重要手段。由于紫杉醇超强的亲脂性和结晶性特点,目前使用药物涂层球囊均为紫杉醇药物涂层。例如库克公司的Advance 18PTX药物涂层球囊采用的就是紫杉醇的单一涂层。手术过程中通过球囊扩张将药物结晶压入血管壁,从而使药物进入血管组织中,并具备一定的缓释效应。然而,由于紫杉醇存在系统毒性大,不利于血管晚期内皮化的缺点,因此,寻找更优的涂层药物迫在眉睫。雷帕霉素（rapamycin,RAP）是一种大环内酯类抗生素免疫抑制剂,临床上常常被用于抑制免疫反应。近年来发现其具有卓越的抗血管内膜增生疗效,而且具备更高的安全性和更宽的治疗区间,使得雷帕霉素成为具有前景的新一代药物涂层球囊的候选药物之一。该药通过与m TOR相互作用,阻断其介导的信号通路传导,降低下游分子核糖体蛋白S6（ribosomal protein S6,rp S6）的磷酸化水平,从而抑制平滑肌细胞的增殖与迁移。然而,相比较于紫杉醇,雷帕霉素亲脂性较差,造成血管转移效率低和组织吸收较慢。同时,雷帕霉素药物分子结晶性差,不易在球囊表面形成稳定的涂层。因此,增加血管壁对雷帕霉素的吸收效率是改善雷帕霉素涂层球囊效果至关重要的环节。应用纳米技术对药物进行改造或者修饰,构建纳米-药物复合涂层有望调控药物本身的物理性质,进而改善药物在组织内渗透,再分布能力及药物滞留时间,弥补雷帕霉素药物涂层球囊应用中的诸多缺陷。首先纳米材料作为雷帕霉素的药物载体,在球囊扩张过程中促进雷帕霉素从球囊表面释放并转移到血管壁组织中,并且可以通过调控纳米材料表面的粗糙度提高药物在球囊表面的附着力,减少药物涂层在到达靶向部位之前的丢失。同时我们可以通过纳米材料的尺寸效应,提高药物的组织穿透能力,帮助药物尽快进入细胞,减少血管内高剪切力对药物吸收的影响。其次,形成纳米材料-雷帕霉素复合体可以实现药物的缓慢释放,解决球囊涂层药物的“爆破释放”问题,消除血药浓度的“峰-谷”现象,有效防止由血药浓度瞬时过高引起的不良反应。近年来,已有研究利用聚合物或金属氧化物等纳米材料负载雷帕霉素形成复合涂层支架,结果显示复合涂层可以持续抑制平滑肌细胞的增殖。但是,聚合物纳米材料存在血液相容性差的问题,可能会引起免疫过敏反应,导致全身毒性,而金属氧化物纳米材料不能在生物体内降解,并且重金属离子可能会引起内皮损伤和增加血小板及嗜中性白细胞的活性。因此,寻找并制备兼具降解性和安全性的纳米材料,对于制备纳米材料-雷帕霉素复合涂层球囊具有重要意义。自然界中,生物体利用其自身强大的调控能力诱导并控制无机材料在体内有序构筑,这个过程被称为生物矿化。研究发现仿生矿化可以有效保护蛋白药物免受蛋白酶降解,大幅度提高蛋白的物理和化学稳定性;矿化形成的磷酸钙具有p H响应的特性,磷酸钙-蛋白结构可以实现蛋白药物的缓慢释放,同时,该策略形成的矿化磷酸钙可以介导蛋白药物进入细胞内发挥作用。另一方面,相比较聚合物涂层,磷酸钙具有适当的生物可降解性及吸收性,不会因为永久存留而引起内皮延迟愈合及晚期再狭窄等问题;其次,纳米磷酸钙具有较强的穿透能力,可以更好的进入血管组织/细胞内,从而抑制平滑肌细胞的迁移和增殖;再有,磷酸钙具有非常优秀的p H响应性,可以在平滑肌细胞溶酶体酸性环境中有效溶解并释放出雷帕霉素药物;同时,在仿生矿化过程中,雷帕霉素可以作为异相成核的模板被包埋在磷酸钙矿物相中,这种结构不但能够提高药物结构的稳定性,还有利于其在体内持续释放。因此,我们选取仿生矿化磷酸钙（calcium phosphate,Ca P）作为雷帕霉素的调控材料制备纳米磷酸钙-雷帕霉素（nanoparticle calcium phosphate-rapamycin,nCaP-RAP）复合涂层,从而延长雷帕霉素在给药后的血管内滞留时间,提高雷帕霉素的血管壁粘附能力和组织内渗透能力。通过仿生矿化的方法制备磷酸钙-雷帕霉素复合涂层,通过调控复合纳米材料的尺寸、形貌、表面电荷、亲水/疏水性等性质,研究不同理化性质对磷酸钙-雷帕霉素复合材料载药量、稳定性和释药性的影响,建立简单和稳定的纳米材料制备方法;研究磷酸钙-雷帕霉素复合涂层的血液相容性,以及对血管平滑肌细胞的作用效果,阐明其作用机制;构建基于磷酸钙-雷帕霉素复合涂层的新型药物球囊,全面评价其体内释药性和血液相容性,研究该球囊在动脉粥样硬化模型中的治疗效果。本研究通过药物涂层的仿生纳米化设计和关键技术创新,为理解并解决药物球囊装置的临床应用瓶颈问题提供切实可行的关键技术和科学方案。第一部分纳米磷酸钙-雷帕霉素复合材料的制备及其性能评价目的通过仿生矿化的方法制备纳米磷酸钙-雷帕霉素复合材料,观察检测其物理化学性质,并检验其体外的释放效率及生物相容性;方法通过将不同浓度的雷帕霉素和Ca Cl2加到DMEM培养液中进行矿化反应的方式制备磷酸钙-雷帕霉素。通过调控复合纳米材料的尺寸、形貌、表面电荷、亲水/疏水性等性质,研究不同理化性质对磷酸钙-雷帕霉素复合材料的稳定性和释药性的影响,建立简单、稳定的纳米材料制备方法。结果通过不断调试与摸索,在Ca Cl220m M的浓度下,在DMEM溶液中矿化反应进行4小时得到分散性好,尺寸均一的纳米颗粒。电镜观察结果可见制备的磷酸钙-雷帕霉素显示均一性,纳米颗粒粒径在200nm左右。结论磷酸钙-雷帕霉素具有良好的生物相容性,可制备后待用以便后续实验。第二部分纳米磷酸钙-雷帕霉素复合材料在体外对平滑肌细胞增殖和迁移的抑制作用的研究目的在DMEM培养基中制备纳米磷酸钙-雷帕霉素复合物,观察纳米颗粒在体外平滑肌细胞中的吞噬效果,对比评估雷帕霉素和磷酸钙-雷帕霉素对平滑肌细胞生长增殖和迁移的抑制作用,以及对血管钙化相关基因表达的影响。方法按之前摸索得出的应用条件,将雷帕霉素和Ca Cl2加到DMEM培养液中进行矿化反应的方式制备磷酸钙-雷帕霉素纳米颗粒。使用CCk-8实验对比研究单纯雷帕霉素和磷酸钙-雷帕霉素纳米颗粒对于平滑肌细胞增殖的抑制作用。同时,使用western-blot和共聚焦显微镜的方法验证雷帕霉素和纳米磷酸钙-雷帕霉素复合材料对于m TOR以及下游靶点磷酸化的抑制作用。另外,我们通过反转录聚合酶链式反应（real time-PCR,RT-PCR）的方式,进一步验证纳米磷酸钙-雷帕霉素复合物对平滑肌钙化相关蛋白的调控作用。结果CCk-8实验结果显示相比较于单纯雷帕霉素,纳米磷酸钙-雷帕霉素复合材料对于平滑肌细胞增殖的抑制作用更强。在低药物浓度（200n M）的条件下,单纯雷帕霉素并不能抑制平滑肌细胞的增殖。然而磷酸钙-雷帕霉素在相同药物浓度的条件下减少30%的平滑肌细胞增殖。Western-blot和免疫荧光实验显示磷酸钙-雷帕霉素对m TOR以及rp S6的磷酸化抑制作用更加明显。另外,磷酸钙并不影响平滑肌细胞钙化相关蛋白的表达。结论纳米磷酸钙-雷帕霉素通过增加平滑肌细胞的吞噬效率,延缓雷帕霉素在胞质中的降解速度,从而增强了雷帕霉素对m TOR及其下游靶点的磷酸化的抑制作用,从而抑制了平滑肌细胞的增殖。第三部分纳米磷酸钙-雷帕霉素复合涂层球囊在新西兰兔髂动脉球囊损伤模型中应用目的通过高脂饮食配合球囊损伤的手术,成功建立新西兰兔髂动脉粥样硬化模型。结合超声喷涂的方式制备纳米磷酸钙-雷帕霉素复合涂层球囊,在动脉粥样硬化模型上验证该复合涂层的治疗效果。方法通过球囊磨损髂动脉内皮,同时配合高脂饮食诱导脂质沉淀的方式,成功建立髂动脉粥样硬化的模型。设置裸球囊组,磷酸钙涂层球囊组,雷帕霉素涂层球囊组和磷酸钙-雷帕霉素球囊组。在球囊损伤后2周,将4组不同球囊植入扩张并且给药,给药前和给药后2周分别做血管造影,观察对比给药前和给药后的血管狭窄情况。同时结合油红染色,HE染色,Masson染色,免疫荧光和RT-PCR等技术手段,验证和对比这些药物球囊的治疗效果。结果低浓度雷帕霉素球囊治疗虽然一定程度上减少斑块内部炎症反应,但是对于斑块内脂质沉积与内膜新生却不能起到抑制作用,因而对于球囊损伤导致的管腔狭窄并不起到改善的作用。然而,在相同的药物浓度的条件下,磷酸钙-雷帕霉素复合涂层球囊对炎症反应和内膜新生抑制作用更强,同时抑制了胶原纤维的沉积,有效减少了球囊损伤和高脂饮食引起的动脉粥样硬化狭窄。结论磷酸钙包裹雷帕霉素增强了血管壁组织对于雷帕霉素的吸收效率与胞质内的驻留时间,从而增强了低浓度雷帕霉素对磷酸化m TOR的抑制作用,因此对动脉粥样硬化斑块的生长具有更明显的抑制作用。