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巴斯德毕赤酵母是高效表达异源蛋白的工业微生物之一,其具有适合高密度发酵、能够进行翻译后修饰等优势。研究毕赤酵母异源蛋白表达系统的重要目标是提高异源蛋白的产量,而筛选强启动子能够提高异源基因的转录水平,从而有效提高异源蛋白的产量。PAOX1是目前应用最广泛的毕赤酵母启动子,其具有很强的活性,但是诱导PAOX1需要使用甲醇,而甲醇具有易燃易爆、有毒等特点,在工业上大量的储存和运输甲醇具有一定的安全风险。PCAT1是毕赤酵母甲醇利用途径中过氧化物酶的启动子,其甲醇诱导活性与PAOX1相当,并且在表达一些特定的酶时,PCAT1的活性比PAOX1高;同时PCAT1在高浓度的葡萄糖中受抑制,在低浓度的葡萄糖中能够被诱导,用PCAT1表达与甲醇诱导相关的转录因子,可以构建基于PAOX1的非甲醇利用型毕赤酵母高表达菌株。然而,截至目前,对PCAT1的研究还比较缺乏。本研究通过改造PCAT1的核心启动区、随机突变PCAT1序列、定向改造PCAT1的转录因子结合位点,筛选活性更强的PCAT1变体,并分析影响PCAT1活性的功能元件,主要的研究内容和结果如下:（1）PCAT1核心启动区的改造通过截短PCAT1-1000序列并表征PCAT1变体的活性,确定PCAT1核心启动区;再将PCAT1核心启动区分成五个部分,分别从PCAT1-1000中敲除部分核心启动区,确定最影响PCAT1活性的区域,用在线预测软件Mat Inspector对PCAT1-1000的转录因子结合位点（TFBSs）进行分析,发现核心启动区中最影响PCAT1活性的区域只有转录因子HAP1.01的结合位点;在PCAT1-1000上重复HAP1.01的结合位点,构建的PCAT1变体甲醇诱导活性明显提升,其甲醇诱导活性相比于对照提高了16%。（2）PCAT1序列的随机突变通过EP-PCR在PCAT1序列中随机地引入突变,用EGFP表征PCAT1变体活性,并进行快速筛选,得到了活力范围在26%～138%（1=WT）的PCAT1启动子库,并且发现PCAT1的-118 bp位置由A突变为G能够提高PCAT1启动子甲醇诱导活力,通过Mat Inspector对PCAT1启动子变体的分析,发现F$YMCM结合位点的减少,以及F$CSRE和F$YGAL结合位点的增多,可能是其提高PCAT1的甲醇诱导活性的原因。（3）定向改造PCAT1的转录因子结合位点（TFBSs）根据Mat Inspector对PCAT1-1000的TFBSs分析结果,通过重复或删除PCAT1的TFBSs进行启动子序列改造,发现重复HAP1.05的结合位点,能够有效提高PCAT1的活性;并结合对PCAT1核心启动区的改造结果,在PCAT1-1000上同时重复HAP1.05和HAP1.01的结合位点,该PCAT1变体的活性大幅提升,其中,在甲醇诱导条件下,用该PCAT1变体表达南极假丝酵母脂肪酶B（CALB）,得到的CALB产量相比于对照提高了77%。