心血管疾病已成为全球疾病死亡的首要原因,高于肿瘤及其他疾病。慢性低水平炎症引起的血管内皮细胞屏障损伤是心血管疾病始动的关键诱因。因此,通过抑制血管内皮细胞炎症是防治心血管疾病的关键一环。活性小分子-牡荆素广泛分布于常见水果、蔬菜、谷物、豆类及各类中草药中,具有防治心血管疾病、抗肿瘤及减脂等功能活性。实验室前期研究及文献调研发现,牡荆素对心血管疾病的防治作用依赖于其突出的抗炎功效,但直接作用的分子靶点未知。药物亲和反应靶向稳定性（Drug affinity responsive target stability,DARTS）联合质谱技术是基于小分子配体结合时靶点蛋白对蛋白酶降解的敏感性降低而发展起来的一项新技术,可用于快速和直接鉴定活性小分子作用的潜在靶点蛋白。因此,本论文以课题组前期的研究结果为基础,采用DARTS联合质谱技术筛选并鉴定牡荆素潜在的靶点蛋白,并通过非标记的生物分子互作、分子对接等技术明确牡荆素与候选靶点蛋白的相互作用及其作用位点;在TNFα联合IL-17诱导的低水平血管内皮细胞炎症模型下,通过Western blot、转录组测序、免疫荧光染色、荧光标记、Me RIP-q PCR等分子生物学技术探究候选靶点蛋白介导牡荆素抗炎改善血管内皮细胞屏障功能的作用及分子机制。主要研究结果如下:1、DARTS分析显示牡荆素可增加SDS-PAGE上分子量约为58 k Da蛋白条带的丰度,并且在该蛋白条带中检测到了牡荆素。综合后续质谱的特征肽、序列覆盖率、分子量比对、评分及丰度等参数,发现该条带代表的蛋白极可能是m RNA去甲基化酶FTO,其是牡荆素作用的候选靶点。采用免疫沉淀法将FTO蛋白特异性富集,也检测到了牡荆素。同时进一步的分子互作分析显示,牡荆素可显著猝灭FTO蛋白的固有荧光强度,并增加了FTO的耐蛋白酶水解性和热稳定性,表明牡荆素与FTO直接结合,且结合能力强于其他三个常见的黄酮类化合物-高良姜素、漆黄素和姜黄素。分子对接结果显示,与多数发现的小分子FTO抑制剂或激动剂不同,牡荆素并不是结合在底物结合区域,而是结合在起催化活性的区域附近,且牡荆素上的羟基和苯环通过与FTO蛋白形成的氢键、疏水相互作用及阳离子-π作用是两者结合的关键驱动力。此外,牡荆素与FTO的结合进一步抑制了低水平炎症所引起的细胞内m6A水平增加,提示FTO依赖的m6A去甲基化很可能介导牡荆素抗炎。2、牡荆素以剂量依赖的方式被血管内皮细胞摄取,并降低了细胞炎症模型下炎症因子ICAM和IL-6的基因及蛋白的表达水平。此外,Western blot、免疫荧光及荧光标记实验表明,牡荆素抑制了炎症引起的紧密连接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1表达的下调以及单层细胞膜通透性的增加,从而改善内皮细胞屏障功能。通过特异性抑制剂FB23阻断FTO的m6A去甲基化活性后,牡荆素丧失了降低细胞炎症模型下ICAM和IL-6表达以及改善内皮细胞屏障功能的作用,表明牡荆素确实通过靶向FTO介导的m6A去甲基化发挥抗炎及细胞屏障保护作用。3、牡荆素可降低炎症因子ICAM和IL-6 m RNA上的m6A水平,并降低其m RNA的稳定性,而FB23处理则使牡荆素失去了降低炎症因子m RNA稳定性的能力,表明ICAM和IL-6是牡荆素激活FTO活性后直接的去甲基化靶m RNA。此外,利用转录组测序技术鉴定到mi R-4786极可能也是FTO直接的m6A去甲基化靶m RNA,并通过SRAMP在线软件预测到其核酸序列上有一个保守的m6A甲基化位点GGACU。此外,mi R-4786表达在炎症下显著下调,而牡荆素显著上调了其表达。进一步通过针对mi R-4786 5′端和3′端的特异性抑制剂处理后,发现牡荆素失去了降低IL-6和ICAM的基因和蛋白表达的能力,表明除了直接影响IL-6和ICAM m RNA上m6A外,牡荆素还可通过间接影响mi R-4786 RNA上m6A及其表达来降低炎症因子的水平。综上所述,牡荆素抗血管内皮细胞炎症的分子机制为:与FTO直接结合并激活其去甲基化酶活性,一方面直接降低IL-6和ICAM m RNA上的m6A水平,另一方面去甲基化mi R-4786上调其表达,共同降低IL-6和ICAM的m RNA稳定性,从而下调炎症因子的蛋白表达,最终发挥抗炎作用。