论文部分内容阅读
结直肠癌(colorectalcancer,CRC)有发病率和死亡率高的特征，是发生在消化道的恶性肿瘤。目前，大量关于结直肠癌的研究集中于结直肠癌的发病机制和治疗的方法，也有文献报道ID1是在结直肠癌中高表达，但是ID1在结直肠癌发生发展中的所起的作用及其调控机制研究较少。
ID蛋白是分化抑制因子（differetiationinhibitoryfactor,ID）位于20号染色体，是bHLH(Basichelix-loop-helix）蛋白家族中重要的成员。ID蛋白可以与碱性的HLH转录蛋白结合，但是，因为ID蛋白没有DNA结合域，所以与HLH转录蛋白结合后，阻止碱性的HLH相互作用形成的活化二聚体，从而抑制碱性的HLH与DNA结合，进而抑制了细胞的分化，使细胞不断的增殖。
我们的课题组前期的研究证明，ID1受到上下游增强子调控。增强子是存在于基因组上的DNA片段，能够增强靶基因表达。超级增强子通常驱动重要基因的表达，对肿瘤致病机理的具有重要的意义。
Crispr/cas9(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/CRISPR-associated9)系统是存在细菌体内一种自我保护外来基因入侵的适应性免疫机制。在这个系统中，Cas9核酸酶与两个RNA结合CRISPRRNA(crRNA)和反式激活的crRNA(tracrRNA)，使核酸序列特异性的裂解。这个系统由两个部分组成，一个是crispr阵列，由重复序列和外源的病毒或外源基因组序列间隔排列而成。间隔序列转录形成CRISPRRNA，重复序列转录形成反式激活的crRNA(tracrRNA)。另一个是cas基因，表达的Cas9核酸酶是一种RNA引导的核酸内切酶，可以在催化位点特异性裂解双链DNA。在免疫过程中切割外源DNA等重要的作用。
本试验根据上述CRISPR/Cas9系统原理，对ID1基因上游的增强子E1和下游增强子E3的核心序列进行敲除。
我们首先通过sgRNA设计网站设计靶向ID1增强子上下游的CRISPRRNA（crRNA）序列，合成的crRNA经过GenCrisprsgRNASynthesisKit试剂盒加工合成单导向RNA（singleguideRNA）。在sgRNA设计阶段，即使选择网站预测切割效率和特异性高的sgRNA序列，其实际的切割效率和特异性的实际效应也是需要经过体外验证来检验的。因此我们使用针对同一靶点设计的不同sgRNA，通过GenCrisprsgRNAScreeningKit试剂盒筛选，评估出有效的sgRNA。
经过体外验证实验确定能够有效定点切割靶基因的sgRNA后，将其序列片断插入到PGMLV-hu6-gRNA质粒载体中。而cas9则由另一个质粒Lentiguide-EF1-cas9表达，将构建好的质粒经过慢病毒包装。我们先用Cas9的慢病毒感染HCT116细胞，Cas9的慢病毒质粒上携带杀稻霉菌素抗性基因，在病毒侵染细胞72h后，用杀稻霉菌素对细胞进行药物筛选7天。挑选到稳定表达cas9的细胞株后，将携带sgRNA的PGMLV-hu6-gRNA质粒转染到细胞中，利用PGMLV-hu6-gRNA质粒表达的荧光标签，通过流式分选的方法，筛选成功转入携带sgRNA质粒的细胞。在此之后，通过极限稀释法培养出单细胞克隆，通过检测目标区域基因片段长度，确定成功切割目的片段的单克隆细胞株。之后，将条件吻合的细胞PCR反应液进行测序验证。经测序验证，我们成功构建了ID1增强子E1、E3单片段敲除的单克隆细胞株，以及同时敲除增强子E1、E3双片段敲除的单克隆细胞株。
得到成功敲除增强子的单克隆细胞株后，通过RT-qPCR和westernblot试验检测敲除ID1增强子后对ID1表达的影响。经RT-qPCR检测结果显示，成功敲除ID1增强子E1、E3以及E1+E3的HCT116单克隆细胞株中ID1的mRNA和蛋白表达水平均明显低于野生型的HCT116细胞。我们用MTT实验和平板克隆形成实验检测敲除ID1增强子后对细胞增殖能力的影响，划痕实验和transwell试验检测其迁移能力。由MTT实验，平板克隆形成实验和划痕实验和transwell试验表明成功敲除ID1增强子E1、E3以及E1+E3的HCT116单克隆细胞株的增殖能力和迁移能力明显均明显低于野生型的HCT116细胞。
本研究利用crispr/cas9技术成功构建了分别敲除ID1增强子E1，E3和同时敲除E1和E3的细胞株，我们发现在HCT116细胞中，敲除ID1增强子后ID1表达量降低，使得细胞的增殖和迁移能力下降。这项研究结果表明，CRISPR/Cas9系统是研究人类致癌基因调控的强有力的工具，而且发现的ID1增强子可作为治疗结肠癌潜在的治疗靶标。
ID蛋白是分化抑制因子（differetiationinhibitoryfactor,ID）位于20号染色体，是bHLH(Basichelix-loop-helix）蛋白家族中重要的成员。ID蛋白可以与碱性的HLH转录蛋白结合，但是，因为ID蛋白没有DNA结合域，所以与HLH转录蛋白结合后，阻止碱性的HLH相互作用形成的活化二聚体，从而抑制碱性的HLH与DNA结合，进而抑制了细胞的分化，使细胞不断的增殖。
我们的课题组前期的研究证明，ID1受到上下游增强子调控。增强子是存在于基因组上的DNA片段，能够增强靶基因表达。超级增强子通常驱动重要基因的表达，对肿瘤致病机理的具有重要的意义。
Crispr/cas9(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/CRISPR-associated9)系统是存在细菌体内一种自我保护外来基因入侵的适应性免疫机制。在这个系统中，Cas9核酸酶与两个RNA结合CRISPRRNA(crRNA)和反式激活的crRNA(tracrRNA)，使核酸序列特异性的裂解。这个系统由两个部分组成，一个是crispr阵列，由重复序列和外源的病毒或外源基因组序列间隔排列而成。间隔序列转录形成CRISPRRNA，重复序列转录形成反式激活的crRNA(tracrRNA)。另一个是cas基因，表达的Cas9核酸酶是一种RNA引导的核酸内切酶，可以在催化位点特异性裂解双链DNA。在免疫过程中切割外源DNA等重要的作用。
本试验根据上述CRISPR/Cas9系统原理，对ID1基因上游的增强子E1和下游增强子E3的核心序列进行敲除。
我们首先通过sgRNA设计网站设计靶向ID1增强子上下游的CRISPRRNA（crRNA）序列，合成的crRNA经过GenCrisprsgRNASynthesisKit试剂盒加工合成单导向RNA（singleguideRNA）。在sgRNA设计阶段，即使选择网站预测切割效率和特异性高的sgRNA序列，其实际的切割效率和特异性的实际效应也是需要经过体外验证来检验的。因此我们使用针对同一靶点设计的不同sgRNA，通过GenCrisprsgRNAScreeningKit试剂盒筛选，评估出有效的sgRNA。
经过体外验证实验确定能够有效定点切割靶基因的sgRNA后，将其序列片断插入到PGMLV-hu6-gRNA质粒载体中。而cas9则由另一个质粒Lentiguide-EF1-cas9表达，将构建好的质粒经过慢病毒包装。我们先用Cas9的慢病毒感染HCT116细胞，Cas9的慢病毒质粒上携带杀稻霉菌素抗性基因，在病毒侵染细胞72h后，用杀稻霉菌素对细胞进行药物筛选7天。挑选到稳定表达cas9的细胞株后，将携带sgRNA的PGMLV-hu6-gRNA质粒转染到细胞中，利用PGMLV-hu6-gRNA质粒表达的荧光标签，通过流式分选的方法，筛选成功转入携带sgRNA质粒的细胞。在此之后，通过极限稀释法培养出单细胞克隆，通过检测目标区域基因片段长度，确定成功切割目的片段的单克隆细胞株。之后，将条件吻合的细胞PCR反应液进行测序验证。经测序验证，我们成功构建了ID1增强子E1、E3单片段敲除的单克隆细胞株，以及同时敲除增强子E1、E3双片段敲除的单克隆细胞株。
得到成功敲除增强子的单克隆细胞株后，通过RT-qPCR和westernblot试验检测敲除ID1增强子后对ID1表达的影响。经RT-qPCR检测结果显示，成功敲除ID1增强子E1、E3以及E1+E3的HCT116单克隆细胞株中ID1的mRNA和蛋白表达水平均明显低于野生型的HCT116细胞。我们用MTT实验和平板克隆形成实验检测敲除ID1增强子后对细胞增殖能力的影响，划痕实验和transwell试验检测其迁移能力。由MTT实验，平板克隆形成实验和划痕实验和transwell试验表明成功敲除ID1增强子E1、E3以及E1+E3的HCT116单克隆细胞株的增殖能力和迁移能力明显均明显低于野生型的HCT116细胞。
本研究利用crispr/cas9技术成功构建了分别敲除ID1增强子E1，E3和同时敲除E1和E3的细胞株，我们发现在HCT116细胞中，敲除ID1增强子后ID1表达量降低，使得细胞的增殖和迁移能力下降。这项研究结果表明，CRISPR/Cas9系统是研究人类致癌基因调控的强有力的工具，而且发现的ID1增强子可作为治疗结肠癌潜在的治疗靶标。