研究背景自从美国国家卫生研究所(NIH)将针灸确立为补充医学后,针刺引起的镇痛效应已被广泛的应用于减轻患者的各种疼痛,尤其是慢性疼痛。大量研究结果表明：针刺镇痛的过程涉及到中枢神经系统各级水平的整合和调节过程。针刺信号主要通过脊髓腹外侧索上传入脑,脑的许多核团共同构成复杂的网络结构参与针刺镇痛,包括导水管周围灰质、中缝大核、蓝斑、下丘脑弓状核、缰核、伏隔核、杏仁核、尾状核、大脑皮层等,但是海马在针刺镇痛中的作用的研究报道还相对较少。我们前期在在结扎坐骨神经造成的慢性神经痛(CCI)大鼠上的研究结果表明：重复电针刺激足三里-阳陵泉具有累积性镇痛效应,该累积效应与其1)上调海马CA3、CA1区神经末梢突触素(SYN)及钙调蛋白激酶(CaMKII)及蛋白激酶A(PKA)蛋白的表达；2)改善CCI引起的海马CA3区神经元突触间隙增宽、突触后致密层(PSD)厚度变薄等等异常变化,良性调节突触的可塑性紧密相关。神经损伤造成的慢性神经痛和炎性疼痛可导致中枢神经系统可塑性的变化。业已证明：在疼痛条件下,海马也发生了形态学、神经元突触的可塑性、和相关的基因及蛋白表达的变化。一氧化氮(NO)是细胞内的逆行信使,参与多种生理学的过程,包括外周及中枢水平的痛觉调制,突触的可塑性,海马长时程增强(LTP,即突触传递效应的增加)以及学习记忆。NO引起的cGMP的生成也参与海马LTP。在脊髓水平,NO参与痛觉过敏的形成和发展,其效应可能是综合效应的结果,既涉及cGMP水平的调节,又包含Ca2+协同作用,以及一些尚未阐明的机制。在细胞内,内流的Ca2+与钙调蛋白(CaM)偶联,共同作用于NOS,以分子氧和L-精氨酸(L-Arg)为底物,产生NO。NO就通过扩散而作用于邻近细胞,或者直接作用于其所在细胞,结合到胞浆可溶型鸟苷酸环化酶(sGC)血红素模体上,使酶发生变构效应而被激活,进而把GTP转化为cGMP,从而增加cGMP,进一步激活cGMP依赖的蛋白激酶G (PKG),从而使脊髓背角伤害感受性神经元兴奋,把伤害性信息进一步传向脑高位中枢,即脊髓水平的NO通过NO-cGMP-PKG信号通路参与伤害性信息的传递过程[55-57]。但是海马NO-cGMP-PKG信号通路是否参与慢性神经病理性疼痛还未见有报道。因此,本实验在大鼠CCI模型上,探讨电针双侧足三里、阳陵泉穴对动物疼痛反应的影响及海马NO-cGMP-PKG信号通路nNOS、cGMP、PKG的表达变化,进一步研究电针缓解慢性神经病理性疼痛的机制,从更深的层次上阐明针刺累积效应的分子生物学机制和科学内涵。为临床针刺治疗慢性痛、进一步推广针灸疗法提供科学依据。材料与方法第一部分实验：取健康雄性Wistar大鼠40只,随机分为正常对照(NOR)组(n=8)、模型(CCI)组(n=8)、EA-2Hz组(电针2Hz)(n=8)、EA-2/15Hz(电针2/15Hz)组(n=8)、EA-1OOHz(电针100Hz)电针组(n=8)。结扎坐骨神经造成CCI慢性痛模型。电针双侧“足三里”-“阳陵泉”穴(2Hz,2/15Hz,100Hz,1mA,1次／D)。用辐射热照射和VON FREY刺激大鼠双侧足底,引起的缩腿反应潜伏期(PWL)的差值作为痛敏分数(HS)判断动物的痛反应。在麻醉状态下,取动物海马组织予以匀浆后,用RT-PCR的方法来检测nNOS, iNOS, PKG mRNA的表达的变化。以选择较佳的电针参数。第二部分实验：取健康雄性Wistar大鼠56只,随机分为正常对照(NOR)组(n=8)、模型(CCI)组(n=8)、EA-2/15Hz组(n=8)、EA+7-NI (nNOS抑制剂)组(n=8)、EA+DMSO (nNOS抑制剂溶剂)组(n=8)、EA+LY83583(sGC抑制剂溶剂)组(n=8)、EA+Ethanol (sGC抑制剂溶剂溶剂)组(n=8)。电针前后四组给予海马CA1区(AP-3.72mm, R/L2.2mm, H2.4mm)微量注射nNOS抑制剂7-NI(15mg/ml)、sGC抑制剂LY83583(3mg/ml),0.5μl/次,隔天1次。然后电针双侧“足三里”-“阳陵泉”穴(2/15Hz,1mA,1次／D),微量注射隔每天1次。用辐射热照射和VON FREY刺激大鼠双侧足底,引起的缩腿反应潜伏期(PWL)的差值作为痛敏分数(HS)判断动物的痛反应。在麻醉状态下,动物取海马组织匀浆后,用Western Blot的方法来检测nNOS.sGC蛋白表达的变化。以验证nNOS, cGMP是否参与电针的效应。结果1)电针对CCI大鼠痛行为的影响与CCI术前(模型组0.35±0.05sec,2Hz电针组0.47±0.12sec,2/15Hz电针组0.37±0.08sec,模型+100Hz组0.30±0.05sec)比较,各组动物的热辐射躲避潜伏期(模型组6.82±0.35sec,2Hz电针组7.07±0.53sec,2/15Hz电针组6.28±1.11sec,模型+100Hz组6.53±0.10sec)明显缩短,痛阈降低(P<0.05)。与同时期模型组比(EA3d：6.78±0.47sec,EA7d：6.02±0.75sec,EA10d：3.92±0.29sec,EA14d2.98±0.39sec),2Hz电针组(3.82±0.89sec,3.55±0.92sec,2.32±0.65sec,2.02±0.35sec)、2/15Hz电针组(3.65±0.75sec,3.05±0.98sec,2.03±0.46sec,1.88±0.31sec)动物的痛阈明显升高,具有统计学差异(P<0.05);而100Hz电针组的痛阈值(4.72±1.20sec,4.40±1.24sec,3.38±0.73sec,2.13±0.38sec)EA3d和EAl4d与模型组比较有统计学意义(P<0.05),EA7d,10d则未见明显变化(P>0.05)。与CCI术前(模型组0.43±0.07sec,2Hz电针组0.40±0.11sec,2/15Hz电针组0.45±0.06sec,100Hz电针组0.47±0.15sec)比较,各组动物的机械痛敏分数(模型组4.20±0.81sec,2Hz电针组3.58±0.29sec,2/15Hz电针组5.00±0.67sec,100Hz电针组4.57±0.88sec)明显缩短,痛阈降低(P<0.05)。与同时期模型组比(EA3d：4.53±0.59sec,EA7d：3.00±0.61sec,EA10d：2.92±0.39sec,EA14d：2.70±0.27sec),2Hz电针组(2.27±0.46sec,2.12±0.37sec,2.47±0.36sec,1.50±0.18sec)、2/15Hz电针组(2.22±0.27sec,2.00±0.23sec,1.47±0.08sec,1.15±0.14sec)动物的痛阈明显升高,具有统计学差异(P<0.05);而100Hz电针组的痛阈值(2.50±0.34sec,2.38±0.28sec,2.52±0.22sec,1.13±0.26sec)EA3d和EA14d与模型组比较有统计学意义(P<0.05),EA7d,10d则未见明显变化(P>0.05)。2)电针对海马NO/cGMP/PKG信号通路相关指标mRNA相对表达量变化的影响荧光定量Real Time-PCR结果显示,CCI术后,与正常对照组比较(0.86±0.07),模型组动物海马nNOS mRNA表达量(1.80±0.36)显著增高(P<0.05)。与模型组比较,2Hz电针组nNOS mRNA的表达量(1.16±0.09)显著降低(P<0.05)；2/15Hz电针组nNOS mRNA的表达量(1.20±0.07)显著降低(P<0.05)；100Hz电针组mRNA的表达量(1.00±0.17)显著降低(P<0.05)。CCI术后,与正常对照组比较(0.92±0.05),模型组动物海马PKG mRNA表达量(1.13±0.11轻度增高(P>0.05)；与模型组比较,2Hz电针组PKG mRNA的表达量(0.81±0.09)显著降低(P<0.05)；2/15Hz电针组PKG mRNA的表达量(0.77±0.07)显著降低(P<0.05)；100Hz电针组mRNA的表达量(0.65±0.11)显著降低(P<0.05)。CCI术后,与正常对照组比较(0.62±0.11),模型组动物海马iNOS mRNA表达量(0.62±0.05)没有变化(P>0.05)；与模型组比较,2Hz电针组PKG mRNA的表达量(0.67±0.03)轻度升高(P>0.05)；2/15Hz电针组PKG mRNA的表达量(0.50±0.02)、100Hz电针组mRNA的表达量(0.52±0.12)轻度降低(P>0.05)。3)海马内注射NOS抑制剂验证NO在针刺累积性镇痛效应中的作用与CCI术前(模型组0.54±0.13sec,EA-2/15Hz组0.23±0.09sec,EA-NI组0.21±0.05sec,EA-LY83583组0.37±0.10sec,EA-DMSO组0.51±0.13sec,模型+ethanol组0.42±0.11sec,)比较,各组动物的热辐射躲避潜伏期(模型组6.55±1.80sec,EA-2／15Hz组7.05±0.87sec,EA-7-NI组6.16±1.76sec,EA-LY83583组6.16±0.59sec,EA-DMSO组6.58±0.80sec,EA-ethanol组5.57±0.82sec,)明显缩短,痛阈降低(P<0.05)。与同时期模型组比(EA7d：5.18±1.24sec,EA10d:4.58±1.14sec,EA14d4.58±0.68sec),EA-2/15Hz组(4.00±1.18sec,2.92±0.51sec,2.00±0.48sec),EA-7-NI组(3.04±0.28sec,1.77±0.53sec,1.46±0.31sec),EA-LY83583组(2.57±0.69sec,1.56±0.21sec,0.94±0.18sec),EA-DMSO组(2.82±0.54sec,1.80±0.65sec,1.17±0.37sec),EA-ethanol组(3.52±0.91sec,2.19±0.61sec,1.83±0.63sec)动物的痛阈明显升高,具有统计学差异(P<0.05)。与CCI术前模型组0.43±0.07sec EA-2/15Hz组0.45±0.11sec,EA-7-NI组0.40±0.06sec,EA-LY83583组0.50±0.13sec,EA-DMSO组0.47±0.15sec, EA-ethanol组0.70±0.19sec,)比较,各组动物的VON FREY躲避潜伏期(模型组5.45±0.90sec,EA-2/15Hz组5.72±0.35sec,EA-7-NI组4.56±1.28sec, EA-LY83583组4.93±0.61sec,EA-DMSO组4.57±0.20sec,EA-ethanol组4.77±0.66sec,)明显缩短,痛阈降低(P<0.05)。与同时期模型组比(EA7d：4.10±1.42sec,EA10d：4.25±1.60sec,EA14d4.33±1.15sec),EA-2/15Hz组(3.03±0.61seG2.58±0.85sec,2.53±0.89sec),EA-7-NI组(2.00±0.95sec,1.66±0.99sec,1.48±0.71sec),EA-LY83583组(2.32±0.59sec,1.28±0.15sec,1.48±0.20sec),EA-DMSO组(2.33±0.26sec,2.51±0.58sec,1.93±0.34sec),EA-ethanol组(2.76±1.10sec,2.09±0.59sec,1.98±0.65sec)动物的痛阈明显升高,具有统计学差异(P<0.05)。Western Blot结果显示,CCI术后,与正常对照组比较(0.97±0.22),模型组动物海马nNOS蛋白表达量(1.12±0.20)轻度增高(P>0.05)。与模型组比较,2/15Hz电针组nNOS mRNA的表达量(1.01±0.22)轻度降低(P>0.05);模型+7-NI(nNOS抑制剂)组mRNA的表达量(1.02±0.23)轻度降低(P>0.05)。CCI术后,与正常对照组比较(0.27±0.03),模型组动物海马sGC蛋白表达量(0.37±0.04)轻度增高(P>0.05)；与模型组比较,2/15电针Hz组sGC蛋白的表达量(0.25±0.10)明显降低(P>0.05)；EA-LY83583组sGC蛋白表达量(0.35±0.05)轻度降低(P>0.05)。小结：1)大鼠坐骨神经慢性压迫性损伤(CCI)可引起的明显的痛反应,上调海马nNOS,PKG mRNA及nNOS, sGC蛋白的表达,说明手术造成的组织损伤引起了疼痛反应时,海马组织nNOS,PKG,sGC活动增强。2)电针双侧“足三里”与“阳陵泉”穴均可缓解CCI引起的明显的痛反应,并且电针2/15Hz组产生的对痛敏的抑制效应稍优于电针2Hz组及100Hz组。3)电针双侧“足三里”或“阳陵泉”穴可显著下调CCI引起的海马内增加的nNOS、PKG mRNA及轻微下调nNOS, sGC蛋白的表达,说明海马内nNOS, PKG,和sGC可能参与电针缓解CCI痛行为反应。4)2Hz、2/15Hz,100Hz电针双侧足三里-阳陵泉穴对CCI大鼠海马iNOS的表达没有明显作用,提示：大鼠海马内iNOS可能不参与疼痛的产生和针刺镇痛的累积效应。