1 研究背景和目的食管鳞癌是最常见的恶性肿瘤之一,全球60%以上的新发病例发生在中国,5年生存率仅20%左右。尽管在理解食管鳞癌分子机制方面取得了进展,但新生物标志物识别、早期诊断和预后改善仍然具有挑战性。高通量代谢组学技术的快速发展为食管鳞癌代谢特征谱绘制、早期诊断和预后标志物筛选、生物学机制破译提供了有力工具。此外,代谢组和转录组整合分析有助于实现对食管鳞癌分子特征和发病机制的全面鉴定。目前,大多数食管鳞癌代谢组研究受限于小样本量,且很少有转录组和代谢组的联合研究,导致我们对食管鳞癌代谢重编程及其机制的了解非常有限。因此,本研究的目的是通过大样本的代谢组学分析,确定食管鳞癌患者血清代谢特征谱并筛选诊断和预后标志物;通过整合转录组和代谢组数据,系统探索食管鳞癌潜在发病机制,提高代谢标志物的可靠性,为食管鳞癌早期发现、预后评估和靶向治疗提供有价值信息。2 方法2.1 纳入450例食管鳞癌患者和588例健康对照,包括发现集（225例患者和363例对照）、第1验证集（146例患者和165例对照）和第2验证集（79例患者和60例对照）。使用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）技术对所有研究对象的血清样品进行广泛靶向代谢组学分析,将三组研究对象血清中具有相同表达水平趋势的差异代谢物视为食管鳞癌患者代谢特征。将发现集研究对象按2:1随机分入训练集（150例患者和242例对照）和测试集（75例患者和121例对照）,在训练集中进行LASSO和随机森林分析,筛选出候选标志物用于诊断模型构建,随后在测试集和两个验证集中进行诊断模型的效能验证。对所有食管鳞癌患者进行KM生存分析、单因素和多种组合的多因素Cox回归分析,以鉴定食管鳞癌预后代谢标志物。使用MetaboAnalyst 5.0软件基于KEGG数据库对差异代谢物进行通路分析。2.2 按照性别和年龄匹配原则,从第一部分代谢组学研究的发现集中随机抽取40例食管鳞癌患者纳入分析。对所有癌组织和癌旁正常组织样品进行转录组测序,使用DESeq2包进行差异基因表达分析,并通过GO富集分析和KEGG通路分析对差异表达基因进行生物学功能识别。利用MetaboAnalyst 5.0软件基于KEGG、HMDB和STITCH数据库对差异表达基因和差异代谢物进行整合分析,在通路和交互网络中全面理解基因与代谢物之间相互作用关系。使用秩和检验比较关键基因在早期和晚期食管鳞癌患者间的表达差异,使用KM方法和对数秩检验法进行生存分析。3 结果3.1 三组研究对象中共有105种差异代谢物具有相同变化趋势,被确定为食管鳞癌代谢改变特征,其中氨基酸类和脂肪酰类是主要的代谢物类别。利用LASSO和随机森林在训练集中筛选出15种代谢物,包括全反式-13,14-二氢视黄醇、（±）-肉豆蔻酰肉碱、（2S,3S）-3-甲基苯丙氨酸、3-（吡唑-1-基）-L-丙氨酸、肉碱C10:1、肉碱C10:1异构体、肉碱C14-OH、肉碱C16:2-OH、肉碱C9:1、刺芒柄花素、猪去氧胆酸、吲哚-3-羧酸、溶血磷脂酰乙醇胺20:3、溶血磷脂酰乙醇胺20:3异构体和消退素E1。作为食管鳞癌早期发现候选标志物,这15种代谢物被用于诊断模型构建和验证。结果显示,该模型在训练集、测试集和发现集中均表现出对食管鳞癌的较高预测效能（准确性和AUC分别为94.9%和0.989、92.57%和0.983、94.22%和0.987）,并且在第1验证集和第2验证集中具有相似的性能（准确性和AUC分别为99.68%和0.999、89.21%和0.958）。对所有患者的差异代谢物进行生存分析、单因素和多种组合的多因素Cox回归分析后,发现3种代谢物在单纯代谢物组合、代谢物与临床指标组合的两种模型中均为食管鳞癌独立预后影响因素,且结果相似。在单纯代谢物组合模型中,高水平的MG（20:4）异构体（HR=1.62）、低水平的9,12-十八碳二烯酸（HR=0.67）和L-异亮氨酸（HR=0.56）与预后不良相关。根据该模型计算所有患者的风险评分,并将患者分为高风险组和低风险组,发现高风险组患者的生存率显著低于低风险组患者,且高风险组具有死亡人数多、MG（20:4）异构体水平高、9,12-十八碳二烯酸和L-异亮氨酸水平低的特征。此外,视黄醇代谢和亚油酸代谢是最显著富集的通路。3.2 共鉴定出2309个食管鳞癌差异表达基因,包括1020个上调基因和1289个下调基因。差异表达基因的GO富集分析和KEGG通路分析显示,最显著富集的生物过程术语、分子功能术语、细胞成分术语和KEGG通路分别为上皮细胞分化（GO:0030855）、信号受体调节活性（GO:0030545）、外部封装结构（GO:0030312）和神经活性配体受体相互作用（hsa04080）。转录组和代谢组数据的整合分析鉴定出7条显著富集的通路和1个代谢物-基因-疾病交互网络。其中神经活性配体受体相互作用是最显著富集的通路,富集到预后标志物MG（20:4）异构体及其受体基因CNR2。亚油酸代谢富集到另一种预后标志物9,12-十八碳二烯酸及其合成和分解代谢酶基因（PLA2G2C、PLA2G2F、CYP2E1、CYP3A4和ALOX15）。视黄醇代谢富集到早期发现标志物全反式-13,14-二氢视黄醇和关键代谢酶基因（ADH1A、ADH1B、ADH4、ADH1C、RPE65、RDH5、CYP26A1、CYP3A4和CYP3A5）。ABC转运蛋白富集到包括预后标志物L-异亮氨酸在内的5种差异代谢物。此外,谷胱甘肽代谢富集到谷胱甘肽和5-L-谷氨酰-L-丙氨酸2种差异代谢物,花生四烯酸代谢富集到20-羟基-二十碳四烯酸,蛋白质消化吸收富集到L-异亮氨酸。在代谢物-基因-疾病交互网络中,富集程度前10位的物质分别为L-精氨酸、睾酮、9,12-十八碳二烯酸、MG（20:4）异构体、三碘甲状腺原氨酸、谷胱甘肽、5-羟基吲哚-3-乙酸、醛固酮、L-组氨酸和雄激素受体。将关键基因与肿瘤分期和生存情况进行关联分析,发现3个上调基因ART4、P2RX1和TACR1在早期癌患者中表达水平较高,且高表达水平的患者生存较好;而2个下调基因KYNU和NPSR1在早期癌患者中表达水平较低,高表达水平的患者生存较差。4结论4.1 代谢组学研究在识别食管鳞癌标志物和关键通路方面具有很大前景。氨基酸和脂质代谢紊乱是食管鳞癌显著的代谢改变特征。血清诊断和预后标志物组合具有良好的预测能力,有望为食管鳞癌高危人群无创监测、个体化风险分层和治疗决策等提供重要工具。此外,选择性靶向视黄醇和亚油酸代谢通路可能成为基于机制的食管鳞癌化学预防和靶向治疗新策略。4.2 转录组学和代谢组学整合分析为基因和代谢改变的相互关系研究提供了新见解。鉴定出的7条关键通路和1个代谢物-基因-疾病交互网络,不仅为阐明代谢物改变的生物调节机制提供了补充证据,而且验证了代谢标志物的可靠性。这些关键通路和交互网络,如神经活性配体受体相互作用、视黄醇代谢和亚油酸代谢,将为食管鳞癌标志物筛选和治疗靶点研究提供新的方向。