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目的：经典的三环类抗抑郁药(tricyclic antidepressants，TCAs)如阿米替林(amitriptyline)、丙咪嗪(imipramine)等在治疗重度抑郁症(major depressive disorder，MDD)中曾经起到重要作用，但其作用机制尚不清楚。近年来发现钾离子通道通过调节腹侧被盖区(ventral tegmental area，VTA)多巴胺能神经元的兴奋性参与抑郁症等情绪障碍性疾病的发生，VTA中钾离子通道与个体对社会挫败应激的抵抗性密切相关。近年来，激活体内对应激的抵抗机制作为一种新的抗抑郁治疗策略提出，一些增强抵抗机制的抗抑郁药物也被发现。但经典抗抑郁药是否通过激活应激抵抗性来发挥抗抑郁作用尚不清楚。本文主要探讨钾通道及其相关的抵抗机制在TCAs抗抑郁效应中的作用，并从转录后修饰的角度研究TCAs影响钾通道表达的分子机制。
方法：采用慢性社会挫败应激模型(chronic social defeat stress，CSDS)诱导小鼠抑郁样行为，通过社会接触实验(social interaction test，SIT)、糖水偏好实验(sucrose preference test，SPT)、悬尾实验(tail suspension test，TST)和强迫游泳实验(forced swimming test， FST )评价小鼠的抑郁样行为；运用实时定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR)和免疫蛋白印迹(western blotting)技术检测目的基因和目的蛋白的表达；VTA脑区立体定位注射特异性过表达m6A去甲基酶脂肪和肥胖相关蛋白(fat mass and obesity associated protein，FTO)的腺相关病毒后，检测钾离子通道mRNA表达变化；VTA脑区注射钾离子通道阻断剂4-氨基吡啶(4-aminopyridine，4-AP)检测其对TCAs抗抑郁效应的影响；采用免疫荧光(immunofluorescence，IF)技术检测N2a细胞上m6A修饰水平。
结果：(1)与对照组相比，应激敏感鼠糖水偏好率明显降低(对照组：87.42±1.483%，应激敏感组：48.42±6.012%，抵抗组：89.06±1.570%，n=16-18，P<0.001)，提示其出现快感缺失样行为。与对照组相比，应激敏感鼠的社会接触比值(target/no target)显著降低(对照组：1.864±0.1019，应激敏感组：0.6125±0.07320，抵抗组：1.817±0.1126，n=16-18，P<0.001)。在target阶段，与对照组小鼠相比，应激敏感鼠在接触区域的停留时间显著降低(对照组：73.10±2.946sec，应激敏感组：31.66±4.573sec，抵抗组：65.53±3.954sec，n=16-18，P<0.001)。(2)TCAs给药两周改善CSDS诱导的小鼠抑郁样行为：CSDS模型鼠给予丙咪嗪治疗后社会接触比值明显增加(CSDS+Vehicle：0.8111±0.1626，CSDS+丙咪嗪：1.311±0.1397，n=10-11，P<0.05)，CSDS模型鼠给予阿米替林治疗后社会接触比值明显增加(CSDS+Vehicle：0.7688±0.1566，CSDS+阿米替林：1.394±0.1870，n=14-15，P<0.05)。(3)腹腔注射阿米替林(10 mg/kg)两周后，应激敏感鼠VTA脑区中KCNG1(对照组：1.000±0.1712，CSDS+Vehicle：1.426±0.2365，CSDS+阿米替林：2.216±0.2157，n=5-6，P<0.05)、KCNF1(对照组：1.000±0.08817，CSDS+Vehicle：0.6674±0.1163，CSDS+阿米替林：1.185±0.1864，n=5，P<0.05)、KCNQ3(对照组：1.000±0.03591，CSDS+Vehicle：0.8456±0.05149，CSDS+阿米替林：1.088±0.06044，n=5-6，P<0.05)、KCNQ2(对照组：1.000±0.03321，CSDS+Vehicle：0.7358±0.08597，CSDS+阿米替林：1.108±0.05406，n=5-6，P<0.01)mRNA表达明显增加，KCNG4、KCNH3、KCNK9、KCNA6、KCNMA1、KCNC1、KCNK4的mRNA表达则无明显变化。(4)腹腔注射阿米替林(10mg/kg，两周)减少正常小鼠TST中不动时间(Vehicle+PBS：155.7±16.03sec，阿米替林+PBS：107.0±16.43sec，n=9-10，P<0.05)和FST不动时间(Vehicle+PBS：85.71±16.89sec，阿米替林+PBS：43.50±9.051sec，n=7-10，P<0.05)，VTA脑区给予4-AP则取消阿米替林在TST(阿米替林+PBS：107.0±16.43sec，阿米替林+4-AP：179.7±21.50sec，n=10，P<0.05)和FST(阿米替林+PBS：43.50±9.051sec，阿米替林+4-AP：110.2±21.46sec，n=10，P<0.05)中对小鼠不动时间的减少作用。(5)与对照组相比，N2a细胞给予丙咪嗪(10μmol/L)和阿米替林(10μmol/L)孵育明显降低m6A修饰水平(对照组：1.000±0.04443，丙咪嗪：0.8172±0.04961，阿米替林：0.8346±0.03300，n=9-13，P<0.05)。(6)与对照组相比，N2a细胞孵育丙咪嗪(10μmol/L)和阿米替林(10μmol/L)明显增加FTO蛋白表达(对照组：1.000±0.06922，丙咪嗪：1.258±0.09743，阿米替林：1.207±0.05763，n=6-8，P<0.05)，但对METTL3和METTL14蛋白表达无明显影响，表明TCAs对m6A的调节作用可能由FTO介导，而非通过METTL3和METTL14的影响。(7)丙咪嗪明显增加正常小鼠VTA脑区FTO蛋白表达(溶剂组：1.000±0.06363，丙咪嗪：1.182±0.04621，阿米替林：0.9344±0.08221，n=5，P<0.05)，而对mPFC、NAc、Hip组织中的FTO蛋白表达没有影响，表明丙咪嗪特异性增加正常小鼠VTA脑区FTO蛋白表达。(8)向模型鼠VTA脑区过表达FTO后，钾通道KCNG1、KCNF1、KCNQ2mRNA水平明显升高；KCNA6mRNA水平明显降低，而KCNQ3、KCNG4、KCNH3、KCNK9、KCNMA1、KCNAB1mRNA水平无明显变化。
结论：TCAs抗抑郁药上调应激敏感鼠VTA脑区KCNG1、KCNF1、KCNQ3、KCNQ2钾通道mRNA表达，可能与其上调m6A去甲基酶FTO的表达有关。阻断VTA脑区钾通道取消TCAs的抗抑郁作用。
方法：采用慢性社会挫败应激模型(chronic social defeat stress，CSDS)诱导小鼠抑郁样行为，通过社会接触实验(social interaction test，SIT)、糖水偏好实验(sucrose preference test，SPT)、悬尾实验(tail suspension test，TST)和强迫游泳实验(forced swimming test， FST )评价小鼠的抑郁样行为；运用实时定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR)和免疫蛋白印迹(western blotting)技术检测目的基因和目的蛋白的表达；VTA脑区立体定位注射特异性过表达m6A去甲基酶脂肪和肥胖相关蛋白(fat mass and obesity associated protein，FTO)的腺相关病毒后，检测钾离子通道mRNA表达变化；VTA脑区注射钾离子通道阻断剂4-氨基吡啶(4-aminopyridine，4-AP)检测其对TCAs抗抑郁效应的影响；采用免疫荧光(immunofluorescence，IF)技术检测N2a细胞上m6A修饰水平。
结果：(1)与对照组相比，应激敏感鼠糖水偏好率明显降低(对照组：87.42±1.483%，应激敏感组：48.42±6.012%，抵抗组：89.06±1.570%，n=16-18，P<0.001)，提示其出现快感缺失样行为。与对照组相比，应激敏感鼠的社会接触比值(target/no target)显著降低(对照组：1.864±0.1019，应激敏感组：0.6125±0.07320，抵抗组：1.817±0.1126，n=16-18，P<0.001)。在target阶段，与对照组小鼠相比，应激敏感鼠在接触区域的停留时间显著降低(对照组：73.10±2.946sec，应激敏感组：31.66±4.573sec，抵抗组：65.53±3.954sec，n=16-18，P<0.001)。(2)TCAs给药两周改善CSDS诱导的小鼠抑郁样行为：CSDS模型鼠给予丙咪嗪治疗后社会接触比值明显增加(CSDS+Vehicle：0.8111±0.1626，CSDS+丙咪嗪：1.311±0.1397，n=10-11，P<0.05)，CSDS模型鼠给予阿米替林治疗后社会接触比值明显增加(CSDS+Vehicle：0.7688±0.1566，CSDS+阿米替林：1.394±0.1870，n=14-15，P<0.05)。(3)腹腔注射阿米替林(10 mg/kg)两周后，应激敏感鼠VTA脑区中KCNG1(对照组：1.000±0.1712，CSDS+Vehicle：1.426±0.2365，CSDS+阿米替林：2.216±0.2157，n=5-6，P<0.05)、KCNF1(对照组：1.000±0.08817，CSDS+Vehicle：0.6674±0.1163，CSDS+阿米替林：1.185±0.1864，n=5，P<0.05)、KCNQ3(对照组：1.000±0.03591，CSDS+Vehicle：0.8456±0.05149，CSDS+阿米替林：1.088±0.06044，n=5-6，P<0.05)、KCNQ2(对照组：1.000±0.03321，CSDS+Vehicle：0.7358±0.08597，CSDS+阿米替林：1.108±0.05406，n=5-6，P<0.01)mRNA表达明显增加，KCNG4、KCNH3、KCNK9、KCNA6、KCNMA1、KCNC1、KCNK4的mRNA表达则无明显变化。(4)腹腔注射阿米替林(10mg/kg，两周)减少正常小鼠TST中不动时间(Vehicle+PBS：155.7±16.03sec，阿米替林+PBS：107.0±16.43sec，n=9-10，P<0.05)和FST不动时间(Vehicle+PBS：85.71±16.89sec，阿米替林+PBS：43.50±9.051sec，n=7-10，P<0.05)，VTA脑区给予4-AP则取消阿米替林在TST(阿米替林+PBS：107.0±16.43sec，阿米替林+4-AP：179.7±21.50sec，n=10，P<0.05)和FST(阿米替林+PBS：43.50±9.051sec，阿米替林+4-AP：110.2±21.46sec，n=10，P<0.05)中对小鼠不动时间的减少作用。(5)与对照组相比，N2a细胞给予丙咪嗪(10μmol/L)和阿米替林(10μmol/L)孵育明显降低m6A修饰水平(对照组：1.000±0.04443，丙咪嗪：0.8172±0.04961，阿米替林：0.8346±0.03300，n=9-13，P<0.05)。(6)与对照组相比，N2a细胞孵育丙咪嗪(10μmol/L)和阿米替林(10μmol/L)明显增加FTO蛋白表达(对照组：1.000±0.06922，丙咪嗪：1.258±0.09743，阿米替林：1.207±0.05763，n=6-8，P<0.05)，但对METTL3和METTL14蛋白表达无明显影响，表明TCAs对m6A的调节作用可能由FTO介导，而非通过METTL3和METTL14的影响。(7)丙咪嗪明显增加正常小鼠VTA脑区FTO蛋白表达(溶剂组：1.000±0.06363，丙咪嗪：1.182±0.04621，阿米替林：0.9344±0.08221，n=5，P<0.05)，而对mPFC、NAc、Hip组织中的FTO蛋白表达没有影响，表明丙咪嗪特异性增加正常小鼠VTA脑区FTO蛋白表达。(8)向模型鼠VTA脑区过表达FTO后，钾通道KCNG1、KCNF1、KCNQ2mRNA水平明显升高；KCNA6mRNA水平明显降低，而KCNQ3、KCNG4、KCNH3、KCNK9、KCNMA1、KCNAB1mRNA水平无明显变化。
结论：TCAs抗抑郁药上调应激敏感鼠VTA脑区KCNG1、KCNF1、KCNQ3、KCNQ2钾通道mRNA表达，可能与其上调m6A去甲基酶FTO的表达有关。阻断VTA脑区钾通道取消TCAs的抗抑郁作用。