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一、蛋白酶体抑制剂硼替佐米对具有Notch1突变的急性T淋巴细胞白血病细胞株生长和凋亡的影响及其机制的研究目的观察蛋白酶体抑制剂硼替佐米(Bortezomib,Bor)在体外对具有Notch1突变的急性T淋巴细胞白血病细胞株MOLT-4细胞生长、凋亡和周期的影响并进一步研究其可能的作用机制。方法苔盼兰活细胞计数法检测细胞增殖；CCK-8法检测细胞活性；Annexin-V/PI双染法检测细胞凋亡；PI染色分析细胞周期；RT-PCR法检测NF-κB(p65)、Notch1下游靶基因Hes1 mRNA的表达。结果硼替佐米对急性T淋巴细胞白血病细胞的增殖抑制作用与硼替佐米的剂量直线相关；并呈剂量、时间依赖性；硼替佐米能诱导MOLT-4凋亡,且诱导细胞凋亡比例呈时间、剂量依赖性；随着硼替佐米浓度的增加,G1期细胞比率逐渐增加,S期逐渐减少；硼替佐米处理后,NF-κB、Hesl mRNA的表达明显下调。结论硼替佐米能通过抑制Notch1活性,同时抑制NF-κB的表达,从而诱导细胞凋亡、抑制MOLT-4细胞的增殖和生长,同时导致细胞周期G1期阻滞。二、硼替佐米对MOLT-4白血病细胞移植瘤裸鼠的抗肿瘤作用及其机制的研究目的研究蛋白酶体抑制剂硼替佐米(Bortezomib,Bor)对具有Notch1突变的急性T淋巴细胞白血病细胞株MOLT-4细胞移植瘤裸鼠的抗肿瘤作用及其可能的机制。方法6周龄雌性Balb/C裸鼠接种前3天起腹腔注射环磷酰胺(CTX),连续2天。隔天在裸鼠右臀皮下接种0.2ml密度为5×107/ml的MOLT-4细胞,接种后干预组分别于(+1d、+4d、+8d、+11d)腹腔内注射硼替佐米,对照组注射同样剂量的生理盐水。观察瘤体生长情况,第64d脱颈处死裸鼠,观察脾脏以及右侧腋窝淋巴结大小,剥离皮下肿瘤并称重,将剥离肿瘤置于10%的中性福尔马林中固定24h,石蜡包埋、切片,作H-E染色。将剥离肿瘤制成细胞悬液,分析肿瘤细胞染色体；RT-PCR法分析Notch1下游靶基因Hes1、c-Myc、Pre-Tα、Deltex1基因表达变化;Western印迹检测NF-κB、Hes1、Caspase9表达变化。结果MOLT-4细胞接种后在裸鼠皮下均成瘤,腹腔用药后观察,对照组明显可见的肿瘤形成时间为3周,而硼替佐米组明显成瘤时间约延迟至4周。硼替佐米可明显抑制MOLT-4细胞在裸鼠体内的生长,硼替佐米组瘤体体积增长速度显著低于对照组,+60天硼替佐米组的移植瘤的体积和重量分别为977.53±475.69mm3和2266.23±376.48mg,对照组的移植瘤体积和重量分别为2850.48±101.84mm3和3678.7±1084.15mg,均显著低于对照组(P<0.01)。且对照组裸鼠右侧腋窝淋巴结以及脾脏均较硼替佐米组明显增大。染色体分析与原代MOLT-4细胞无明显变化；HE染色显示：硼替佐米组的肿瘤细胞出现明显细胞分化、凋亡等形态学改变,并可形成凋亡小体。硼替佐米可以下调移植瘤细胞Notch1下游靶基因Hes1、c-Myc、Pre-Tα、Deltex1 mRNA的表达；Western结果显示硼替佐米组NF-κB、Hes1蛋白表达均较对照组明显下降,而Caspase3、Caspase9蛋白的表达均较对照组明显增加。结论硼替佐米在体内环境中也能发挥抑制急性T淋巴细胞白血病细胞的增殖和生长作用。同时也能抑制白血病细胞在体内的组织浸润转移能力。除了通过诱导MOLT-4细胞的凋亡之外,通过抑制MOLT-4细胞NF-κB的表达以及抑制Notch1活化也是其抗肿瘤作用的重要机制之一。硼替佐米不改变MOLT-4细胞的遗传学特征。三、硼替佐米对过表达Notchl胞内段(ICN1)诱发的急性T淋巴细胞白血病小鼠生存的改善及其作用机制的研究目的研究蛋白酶体抑制剂硼替佐米(Bortezomib,Bor)对过表达Notch1胞内段(ICN1)诱发的急性T淋巴细胞白血病小鼠的抗白血病作用及其可能的机制方法以过表达Notch1胞内段(ICN1-GFP)的小鼠急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)为模型,随机分为对照(PBS)组和Bor组,观察两组小鼠生存状况；流式细胞检测硼替佐米组以及对照组小鼠外周血及骨髓白血病细胞的比率变化,并对白血病小鼠肝脾行病理及免疫组化检测；RT-PCR法分析骨髓白血病细胞Notch1下游靶基因Hes1、c-Myc、Pre-Tα、Deltex1基因表达变化,Western印迹检测NF-κB、Hes1、Caspase3、Caspase9表达变化。结果对照组小鼠在移植后21天大部分死亡,死亡前表现出明显的恶病质、弓背以及活动量的减少,而硼替佐米处理组小鼠白血病进展较对照组明显减漫、生存时间延长(P=0.0172)；硼替佐米组小鼠外周血及骨髓细胞中ICN1-GFP的表达率明显低于对照组,硼替佐米组小鼠肝脾白血病细胞浸润较对照组明显减少,而Caspase3、Caspase9表达增加,Notch1、NF-κB表达明显下降；硼替佐米可以下调骨髓白血病细胞Notch 1下游靶基因Hes1、c-Myc、Pre-Tα、Deltexl mRNA的表达；Western结果显示硼替佐米组NF-κB, Hes1蛋白表达均较对照组明显下降,而Caspase3、Caspase9蛋白的表达均较对照组明显增加。结论硼替佐米可明显改善过表达ICN1的T-ALL小鼠生存,主要通过抑制白血病细胞在小鼠各脏器的浸润以及诱导白血病细胞的凋亡,从而起有效的抗白血病作用,其作用机制可能是硼替佐米对Notch1以及NF-κB通路的协同抑制的结果。