研究植物次生代谢产物对害螨的作用机制是开发新型植物源杀螨剂的重要策略。滨蒿内酯是一种简单的天然香豆素类衍生物,可从中草药茵陈蒿（Artemisia capillaris Thunb.）中分离提取获得,对害螨具有高效的杀螨活性,但其作用机制和靶点仍不清楚。本论文旨在系统地探索滨蒿内酯对朱砂叶螨（Tetranychus cinnabarinus）杀螨的潜在分子靶点,并为指导未来将滨蒿内酯用作全球农业害螨的杀螨药剂提供基础支撑。本文利用RNA-Seq、RNAi技术、荧光标记[Ca2+]i浓度测定技术、原核表达技术、真核表达技术、GST pull-down技术和电压钳技术等实验技术,全面而系统地对滨蒿内酯的杀螨机制和和潜在分子靶点进行探讨;以新颖靶点Ca2+信号通路为切入点,从分子靶标筛选、功能基因分析和活性靶点验证三个层次系统揭示了滨蒿内酯杀螨活性的毒理学分子机制,明确了滨蒿内酯杀螨的作用机理和分子靶标,揭示天然产物滨蒿内酯杀螨活性的新颖靶标位点,主要结果如下:1滨蒿内酯对朱砂叶螨杀螨活性相关的候选靶基因的筛选及鉴定荧光标记[Ca2+]i浓度测定表明,滨蒿内酯以剂量依赖性方式显著增加昆虫Sf9（Spodoptera frugiperda,草地贪夜蛾）细胞中的[Ca2+]i水平。其次,滨蒿内酯胁迫下朱砂叶螨的RNA-Seq数据分析表明:在滨蒿内酯和溶剂处理害螨48 h后,251个基因被确定为显著差异表达基因,其中192个基因上调,59个基因下调;使用GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）数据库对差异基因进行功能富集分析表明,在GO和KEGG分析的前10个富集条目中,最富集的条目分别是“VGCC复合物”和“钙信号通路”。这些结果表明,朱砂叶螨体内的Ca2+信号通路基因被滨蒿内酯过度激活。PPI（Protein-Protein Interaction）互作网络分析显示,钙调蛋白（Ca M1）是L-、T-和N-VGCC的主要相关信号分子;q PCR和RT-PCR分析表明,VGCCs和Ca Ms介导的钙信号通路的基因表达被不同浓度滨蒿内酯(LC70、LC50和LC30)激活;与其他Ca2+信号通路基因相比,滨蒿内酯对L-VGCC和Ca M1基因表达的上调更为显著。最终,确定了1条L型-电压门控Ca2+通道（VGCC）（Tc L-VGCC）、1条T型VGCC（Tc T-VGCC）、1条N型VGCC（Tc N-VGCC）和5条钙调蛋白（Ca M）（Tc Ca M1-5）介导的“钙信号通路”基因作为滨蒿内酯对朱砂叶螨杀螨活性相关的候选靶基因进行下一步研究。2朱砂叶螨Ca2+通道（Tc L-VGCC、Tc N-VGCC、Tc T-VGCC）和钙调蛋白（Tc Ca M1-5）基因的生物学功能2.1朱砂叶螨3条钙离子通道基因（Tc L-、Tc T-、Tc N-VGCC）和5条钙调蛋白基因（Tc Ca M1-5）的克隆及序列分析序列比对分析结果表明,3条钙离子通道基因（Tc L-、Tc T-、Tc N-VGCC）都有四个功能区（结构域I-IV）,每个功能区由6个跨膜α-螺旋片段（S1-S6）组成;Tc Ca M1和Tc Ca M5分别包含4个和2个EF-hand结构域,Tc Ca M3包含1个跨膜α-螺旋,Tc Ca M2和Tc Ca M4不具有任何功能结构域;进化树分析表明,Tc L-、Tc T-、Tc N-VGCC与相应的昆虫纲、蛛形纲亲缘关系近,Tc Ca M1和Tc Ca M5与相应的蛛形纲亲缘关系近,Tc Ca M2、Tc Ca M3和Tc Ca M4与相应的昆虫纲亲缘关系近,而都与哺乳动物亲缘关系远;q PCR和RT-PCR分析表明,Tc L-、Tc T-、Tc N-VGCC和Tc Ca M1-5基因在朱砂叶螨所有发育阶段（卵,幼螨,若螨和成螨）都有表达。2.2朱砂叶螨Ca2+通道（Tc L-、N-、T-VGCC）和钙调蛋白（Tc Ca M1-5）基因的RNAi研究q PCR和RT-PCR分析表明,与对照组相比,单独沉默Tc L-、Tc T-、Tc N-VGCC和Tc Ca M1-5基因的RNAi效率为50-72%;此外,L-VGCC和Ca M1的同时RNAi效率分别为68%和60%;生物测定结果表明,分别沉默Tc L-VGCC和Tc Ca M1基因的螨的死亡率显著低于对照组（分别为7.27倍和5.51倍）,且同时沉默L-VGCC和Ca M1基因对螨虫死亡率的影响最大（11.48倍）,表明Ca M1-和L-VGCC-介导的Ca2+信号通路基因在滨蒿内酯的杀螨机制中扮演着最重要的角色。3滨蒿内酯激活朱砂叶螨Ca M1和L-VGCC基因介导的Ca2+信号通路的分子机制钙调蛋白（Ca M）活性检测表明,滨蒿内酯在体外可以间接激活原核表达的Ca M1重组蛋白,其EC50值为4.92μM;细胞内[Ca2+]i浓度分析表明,滨蒿内酯处理过表达Ca M1的Sf9细胞中的[Ca2+]i显著高于GFP表达细胞中的[Ca2+]i,证实了滨蒿内酯激活了Ca M1介导的螨体内Ca2+信号通路。电生理分析表明,在没有Ca M1的情况下,滨蒿内酯显著增加了仅表达L-VGCC的卵母细胞中的电流,EC50值为5.54μM;与Ca M1不同,在高浓度（＞10μM）作用下,单独使用滨蒿内酯不会阻断Ca2+通道活性;Ca M1增强了滨蒿内酯对L-VGCC钙通道的激活作用;滨蒿内酯显著增强Ca M1介导的Ca2+依赖性促进（CDF）和阻断Ca M1介导的Ca2+依赖性失活（CDI）。4滨蒿内酯对朱砂叶螨Ca M1和L-VGCC介导的Ca2+信号通路的靶标定位4.1朱砂叶螨钙调蛋白（Ca M1）对L-型Ca2+通道（L-VGCC）的调控机制GST pull-down分析表明,钙调蛋白（Ca M1）可以与L-VGCC的N-末端（NT）和C-末端（CT）的近端CT1基序(CT1（包括EF-hand、Pre IQ和IQ基序）、CT1B（包括Pre IQ和IQ基序）、Pre IQ和IQ结合且呈浓度依赖性;在1 m M Ca2+浓度条件下,多个Ca M1分子可与L-VGCC的C-末端（CT）的CT1B或CT1结合;Ca M与Ca2+通道的N-末端（NT）结合需要较高的[Ca2+]i;在1 m M Ca2+浓度条件下,对Ca M1与GST融合蛋白亲和力的大小进行排序,顺序如下:CT1B＞CT1≈IQ＞Pre IQ＞NT;在100 n M Ca2+浓度条件下,对Ca M1与GST融合蛋白亲和力的大小进行排序,顺序如下:Pre IQ＞NT＞CT1B＞CT1＞IQ。4.2滨蒿内酯对朱砂叶螨Ca M1和L-VGCC介导的Ca2+信号通路的靶向调控位点GST pull-down分析表明,滨蒿内酯显著促进了钙调蛋白（Ca M1）与L型-Ca2+通道（L-VGCC）的C-末端的IQ结构域的结合;L型-Ca2+通道（L-VGCC）中的IQ结构域（Ca M1结合的保守基序）突变为AA基序,显著降低其与Ca M1的结合能力（下降了66.78%）。电生理实验表明,野生型Ca2+通道（L-VGCC）（WT-IQ）显示出显著的Ca2+依赖性失活（CDI）;与WT-IQ通道相比,突变型L-VGCC（MT-AA）通道的CDI值比其高了2.72倍,而MT-AA通道的CDF值比其低了1.51倍,结果表明,L-VGCC的IQ基序突变促进了Ca2+通道的CDI并阻断了Ca2+通道的CDF;在表达突变型Ca2+通道（MT-AA）并用滨蒿内酯(EC50,5.54μM)预处理的卵母细胞中,表现显著的Ca2+依赖性失活（CDI）,结果表明,滨蒿内酯通过增强Ca M1-IQ相互作用从而阻断Ca M介导的L-VGCC的CDI或促进CDF。5滨蒿内酯对朱砂叶螨杀螨作用的新靶点功能根据目前的研究结果,得出滨蒿内酯对朱砂叶螨Ca M1和L-VGCC介导的Ca2+信号通路的靶向调控位点的模型:在低[Ca2+]i下,Ca M主要以无Ca2+形式（apo Ca M）存在,并以相对较高的亲和力与Pre IQ(Ca2+通道的CT基序)相互作用,产生基础通道活性。由于apo Ca M对IQ/NT区域的亲和力相对较低,它们之间的相互作用可能很小。然而,当[Ca2+]i增加时,Ca2+与Ca M结合,形成Ca2+/Ca M,其与IQ基序具有较高的亲和力,从而触发促进Ca2+依赖性促进（CDF）。滨蒿内酯作为激动剂在该位点诱导IQ/Ca M结合,然后以浓度依赖性方式诱导Ca2+通道活性。综上所述,本研究表明,滨蒿内酯的作用方式涉及靶向Ca M1和L-VGCC之间的界面以及调节下游Ca2+信号通路。有趣的是,Ca M1增强了滨蒿内酯的通道激活作用。滨蒿内酯激活Ca M结合位点,该位点位于Ca2+通道C-末端的IQ基序中。因此,IQ基序可能是一种有前途的新型“绿色杀螨剂”结合的新靶标位点。它的鉴定可能会加速新型杀螨剂的开发,以控制全球范围内的破坏性植食性害螨。此外,本研究的结果可能有助于开发基于L-VGCC的靶标特异性绿色杀螨化合物。