糖尿病肾病(DN)是指糖尿病时发生的肾小球、肾小管、肾间质和肾血管病变，是糖尿病(DM)最常见、最严重的微血管并发症之一，常常发展为终末期肾功能衰竭。近年来全球DN发病率逐年增加，已成为严重危害人类生命及生活质量的重大疾病之一。研究DN的发病机制、寻找更有效的防治手段已成为全世界糖尿病学者共同的研究课题。DN的主要表现是肾功能障碍及肾脏结构损害，两者可以互相促进、互为因果。大量的研究显示，高糖环境及代谢紊乱产生的大量糖基化终末产物可使机体处于氧化应激状态、激活肾脏局部的肾素血管紧张素系统、引起肾脏局部炎症改变，进而引起肾脏血流动力学异常、局部各种细胞因子大量释放，最终导致肾脏结构损害、功能异常，包括细胞外基质大量增生(肾小球基底膜增厚、系膜区扩大、肾小管基底膜增厚、间质纤维化)、足细胞损伤(足细胞数量减少、结构破坏)、肾小球滤过功能下降、尿蛋白增加。根据以上发病机制，临床及动物实验在DN的治疗上进行了大量有益的探索，但或因结果不满意或副作用过大，大多未能实际应用。目前临床针对DN的治疗主要还是控制血糖、控制血压及饮食控制。近几年来中医中药防治DN显示出一定的优势，能不同程度地改善肾脏功能、减轻临床症状。随着DN发病机制中炎症反应、氧化损伤研究的逐渐深入，具有抗炎、抗氧化作用的中药被引入DN的治疗药物之列。黄芩苷(baicalin Bai)具有抗菌、消炎和抗感染等药理作用。近年来，随着对传统中药新用途的开发，对黄芩苷的研究日趋深入，发现黄芩苷在防治DN中发挥着重要作用。临床实验显示，黄芩苷可改善肾脏排泄功能，对AR活性有抑制作用。但对于黄芩苷抗炎、抗氧化作用的研究较少。本实验拟从DN大鼠肾脏局部细胞因子、炎症因子、氧化应激反应之间的关系入手，从蛋白及分子水平上寻找黄芩苷的作用位点，探讨其治疗机制，为中医药防治糖尿病并发症提供新的视角和实验依据。1材料与方法1．1 DN大鼠模型的建立体重230～300g SPF级雄性SD大鼠，随机分为正常对照组及DN模型组。正常对照组称重并尾部针刺取血测定血糖后腹腔注射缓冲液。DN模型组大鼠禁食10小时后，称体重并尾部针刺取血测定基础血糖，按2％STZ溶液55mg／kg体重单次腹腔注射。1周后，造模大鼠餐后血糖≥16mmol／L诊断为DM。DM成模大鼠监测24小时尿蛋白及尿肌酐排泄量。6周后，尿蛋白稳定高于500mg／L者，可临床诊断DN。检测各大鼠体重、血糖、尿肌酐、尿蛋白。1．2黄芩苷改善DN大鼠肾功能实验DN成模大鼠根据其体重、血糖、尿肌酐、尿蛋白等指标配对分为3个组，即模型组、黄芩苷低剂量组、黄芩苷高剂量组。3组大鼠进行组间比较，体重、血糖、尿肌酐、尿微量蛋白的差别均无统计学意义，P＞0.05。以上指标相差较远而无法配对的大鼠不参加实验。最后参加实验的大鼠为：正常对照组5只，模型组、黄芩苷低剂量组、黄芩苷高剂量组各7只。各组大鼠控制食物量25g／只／天，自由饮水。正常组大鼠不予处理；模型组大鼠腹腔注射注射用水1ml／只／天；黄芩苷低剂量组大鼠腹腔注射黄芩苷水溶液40mg／kg／天；黄芩苷高剂量组大鼠腹腔注射黄芩苷水溶液60mg／kg／天。治疗6周后，检测各组大鼠体重、血糖、尿肌酐、血肌酐、尿蛋白，进行治疗前后对比及组间对比，观察疗效。1．3黄芩苷改善DN大鼠肾脏结构实验动物分组及治疗情况同前。治疗6周后，各组大鼠肾脏称重，取数条皮质固定于3％戊二醛固定液中做电镜检查，其余肾组织固定于10％福尔马林固定液中进行病理检查，观察疗效。1．4黄芩苷调节DN大鼠肾脏局部生物活性物质实验动物分组及治疗情况同前。治疗6周后，取各组大鼠血液及肾脏，放射免疫法检测AngⅡ，免疫组织化学方法检测TGF-β1、NF-κB含量及PKC活性。1．5黄芩苷干预DN大鼠肾脏氧化应激反应实验动物分组及治疗情况同前。治疗6周后，取各组大鼠肾脏，部分肾组织匀浆后检测相关抗氧化酶SOD、GSH-PX。2结果2．1 DN大鼠模型的建立DN大鼠体重减轻、血糖升高、尿蛋白增多，与正常组比较，差异有统计学意义，P＜0.05。尿肌酐排泄量较正常组下降，但无统计学意义。根据DN进程，早期DN表现为GFR升高，进入临床期后GFR逐渐下降，故该结果提示本实验大鼠已进入临床DN期。2．2黄芩苷改善DN大鼠肾功能实验DN大鼠经黄芩苷治疗后，低、高剂量组血糖下降，与模型组之间差别有统计学意义，P＜0.05；但两组血糖仍高于正常对照，与正常组比较，差别也有统计学意义，P＜0.05；其中以低剂量组降糖作用较好。低、高剂量组体重增加，与模型组比较差别有统计学意义，P＜0.05；与正常组的体重差别也有统计学意义，这是由于治疗前DN各组与正常组之间已有体重差异所致。但治疗期间低、高剂量组体重增加的幅度与正常组相近，差别无统计学意义。低、高剂量组尿蛋白减少，与模型组差别有统计学意义，P＜0.05；其中低剂量组与正常组之间差别无统计学意义，高剂量组与正常组之间差别有统计学意义。说明低剂量组降低尿蛋白作用较好。模型组尿肌酐排泄量降低，与正常组比较差别有统计学意义，P＜0.05。低剂量组尿肌酐升高，与模型组比较差别有统计学意义，P＜0.05；而高剂量组尿肌酐与治疗前无明显区别，与模型组比较差别无统计学意义，P＞0.05；与正常组比较差别有统计学意义，P＜0.05。血肌酐比较结果显示，DN三组血肌酐与正常组比较差别均有统计学意义，说明有代谢产物在体内潴留，其中低剂量组血肌酐值较低，与模型组比较差别有统计学意义，P＜0.05；与高剂量组比较差别亦有统计学意义，P＜0.05。高剂量组血肌酐值和模型组差别无统计学意义，P＞0.05。实验结果显示，黄芩苷可部分降低血糖，改善DN大鼠肾脏排泄功能，低剂量组疗效优于高剂量组。2．3黄芩苷改善DN大鼠肾脏结构实验DN大鼠经黄芩苷治疗后，低、高剂量组肾指数减少，与模型组比较差别有统计学意义，P＜0.05；与正常组比较，差别也有统计学意义，P＜0.05，低剂量组更接近正常组。说明黄芩苷可部分减轻DN大鼠肾脏肥大。镜下观察，低、高剂量与模型组比较，肾小球增大情况减轻，PAS染色阳性物质面积减少，FN、Ⅳ-C表达减少，电镜可见基底膜增厚情况减轻，损伤的足细胞修复，部分区域可见正常足突排列；肾小管上皮仍可见细胞水肿，肾小管Ⅳ-C表达减少；间质纤维化及炎细胞浸润减轻。数据统计显示，低、高剂量组肾小球PAS阳性物质、FN与模型组差别均有统计学意义，P＜0.05；与正常组比较差别无统计学意义，P＞0.05，以低剂量组更接近正常组。低剂量组降低肾小管Ⅳ-C表达与模型组比较，差别有统计学意义，P＜0.05；高剂量组与模型组之间差别无统计学意义，P＞0.05。实验结果显示，黄芩苷可降低FN、Ⅳ-C在肾小球、肾小管的沉积，减轻基底膜增厚，从而减轻肾脏肥大。低剂量组疗效优于高剂量组。2．4黄芩苷调节DN大鼠肾脏局部生物活性物质实验DN大鼠经黄芩苷治疗后，低、高剂量组血AngⅡ降低，与模型组比较差别有统计学意义，P＜0.05：肾组织中AngⅡ无明显差异。低、高剂量组肾小管TGF-B1表达与模型组比较明显减少，其中以低剂量组更接近正常对照组的表现。模型组肾小管上皮细胞膜PKC表达增加，低、高剂量组肾小管上皮细胞膜PKC表达减少，低剂量组更接近正常组。NF-κB在肾小球为弱阳性表达，四组间无明显差异。实验结果显示，黄芩苷可降低血AngⅡ，对改善肾脏血流动力学有一定帮助。黄芩苷可降低肾组织内增高的TGF-B1、PKC，从而调节ECM的沉积和降解。2．5黄芩苷干预DN大鼠肾脏氧化应激反应实验DN大鼠经黄芩苷治疗后，低、高剂量组肾组织内SOD升高，与模型组比较差别有统计学意义，P＜0.05；与正常组比较差别无统计学意义，P＞0.05。GSH-PX在四组间无统计学意义，但模型组GSH-PX降低，黄芩苷低、高剂量组GSH-PX较模型组升高，与正常组接近。实验结果显示，黄芩苷可提高DN时降低的抗氧化酶SOD、GSH-PX，对肾脏局部的氧化应激反应有一定的阻止作用。3结论上述实验结果表明，黄芩苷具有治疗DN的作用，其主要作用有：①部分降低血糖，改善大鼠一般状况；②提高GFR，减少蛋白尿，改善肾功能：③减少ECM沉积，改善肾脏结构。黄芩苷治疗DN的机制可能与其降低血AngⅡ含量、下调肾脏微环境中TGF-B1、PKC活性及提高SOD、GSH-PX抗氧化酶活性有关。实验中阴性结果分析，肾组织中AngⅡ在各组间无差异可能与肾组织匀浆造成的AngⅡ稀释有关；NF-κB呈弱阳性表达，且在各组间无明显差异可能与免疫组化对该指标不敏感有关。