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一、研究背景支气管哮喘是气道的慢性炎症性、过敏性疾病,其反复发作可引起气道重塑,近年来成为支气管哮喘（简称哮喘）研究中的一个亮点。气道重塑指的是哮喘中发生于气道壁的结构改变,这些改变包括上皮细胞的增生和化生,上皮下纤维化,肌细胞增生和血管发生。气道平滑肌细胞（airway smooth muscle cells,ASMCs）是气道主要的结构和功能细胞,在气道重塑中起重要作用,哮喘时ASMC生物学特性发生很大变化,包括增生,肥大,迁移等,不仅使支气管对刺激的收缩反应更强烈,加重气道高反应性,而且增殖的ASMC使气道壁增厚,导致基础气道阻力增加和不可逆性气流阻塞的发生。与张力蛋白和辅助蛋白同源,第10号染色体丢失的磷酸酶基因（phophataseand tensin homolog deleted on chromosone 10,PTEN）是近年来发现的一种新的抑癌基因,是至今发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因。PTEN作为一种具有双重磷酸酶活性的肿瘤抑制因子,在中枢神经系统、心脏、肝脏、肾脏、胃肠道、肺脏及皮肤等全身多器官均有表达,是一种细胞内固有表达的非分泌型蛋白。正常组织内PTEN的广泛表达及其基础活性的存在,提示PTEN参与了多种生理过程,对细胞的生长、增殖、分化、凋亡、黏附、迁移和血管生长等许多生物学行为有重要影响。近年来,对PTEN的研究逐渐从肿瘤领域延伸到一些非肿瘤领域中,随着研究的深入人们发现其在如:心肌肥大,高血压动脉粥样硬化,支气管哮喘哮等非肿瘤性疾病中也发挥重要的作用。已有的研究已经证实PTEN可以通过对磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）、细胞外信号调节激酶（ERK）及黏着斑激酶（FAK）等信号通路的抑制来抑制肿瘤细胞,心肌和血管平滑肌等细胞的增殖、迁移。PI3K/PKB/AKT通路同时是介导ASMC增殖的主要信号传导通路。因此我们推断PTEN对ASMC的增殖也有类似的影响,可以通过对PI3K/PKB/AKT通路的抑制来抑制ASMC增殖,提高人气道平滑肌细胞G0/G1期细胞的比例,阻滞细胞周期进程,。二、研究目的本实验以体外培养的HASMCs为研究对象,观察携带野生型PTEN基因的重组腺病毒（Ad-PTEN）体外转染体外培养的人气道平滑肌细胞（HASMC）后的表达,研究其对体外培养的HASMC增殖的影响,并对其作用机制作初步的探讨,为其治疗支气管哮喘气道重构提供实验依据。三、材料与方法1、经患者同意,取南方医院胸外科同期做肺叶切除术患者的正常肺叶、段支气管标本。2、组织块贴壁法培养人支气管平滑肌细胞,倒置显微镜观察和抗平滑肌α肌动蛋白单克隆抗体（α-actin）免疫细胞化学法进行HASMCs鉴定。3、通过携带野生型PTEN基因的重组腺病毒（Ad-PTEN）体外转染体外培养的人气道平滑肌细胞构建过度表达PTEN的原代培养气道平滑肌细胞模型,通过追踪绿色荧光蛋白（GFP）的表达,检测不同感染倍数（M.O.I.）的感染效率,以及感染后24h,48h和72h时GFP表达阳性率,确定合适的感染倍数和病毒表达时间。4、用RT-PCR及Western Blot检测受感染细胞内PTEN的mRNA及蛋白表达,检测通过腺病毒感染介导能否有效地引起气道平滑肌细胞内过度表达PTEN。5、MTS/PMS微量比色法检测各组吸光度（OD490值）以了解HASMC的增殖情况。6、各组细胞PI单染后流式细胞仪测定细胞周期分布。7、Western Blot检测各组细胞Akt及p-Akt的蛋白表达。8、RT-PCR检测各组细胞P21mRNA的表达。9、采用SPSS13.0统计软件进行结果分析,统计数据用均数±标准差（（?）±S）表示,组间比较用one-way ANOVA分析,多重比较用LSD,P＜0.05为差异有统计学意义。四、结果1、HASMCs的形态及免疫细胞化学鉴定倒置显微镜下ASMCs呈长梭形,生长至融合后,细胞呈现出特征的“峰谷”状。免疫细胞化学法对平滑肌细胞表型标志物α-肌动蛋白（α-actin）鉴定,光镜下可见细胞浆中较多棕黄色颗粒。2、Ad-PTEN和Ad-GFP感染气道平滑肌细胞后,GFP表达阳性率随着M.O.I.和时间增加而增加;M.O.I.达到100时,细胞GFP阳性率达到98%以上;M.O.I.200感染效率较M.O.I.100细胞无明显变化;各种M.O.I.感染48h后,GFP阳性表达趋于稳定,72h荧光表达阳性细胞比较48h时无明显改变,主要表现为荧光强度增强。因此确定M.O.I.100感染气道平滑肌细胞48h后作为进行后续实验的适宜表达时间。3、RT-PCR同时扩增Ad-PTEN转染组,Ad-GFP转染组和对照组PTENmRNA,结果显示Ad-PTEN转染组PTEN mRNA的表达水平显著高于Ad-GFP转染组和对照组（P＜0.05）,Ad-GFP转染组与对照组间差异无统计学意义（P＞0.05）。Western Blot检测结果显示,Ad-PTEN转染组PTEN蛋白表达水平显著高于Ad-GFP转染组和对照组（P＜0.05）,Ad-GFP转染组与对照组间差异无统计学意义（P＞0.05）。提示携带外源基因PTEN的腺病毒感染气道平滑肌细胞后,Ad-PTEN转染组细胞内过度表达PTEN mRNA及蛋白。4、MTS/PMS法检测携带野生型PTEN基因的重组腺病毒（Ad-PTEN）转染对HASMCs增殖的影响,结果显示Ad-PTEN转染组细胞的吸光度（OD490值）显著低于Ad-GFP转染组和对照组（P＜0.05）;而Ad-GFP转染组与对照组间差异无统计学意义（P＞0.05）。5、流式细胞仪检测携带野生型PTEN基因的重组腺病毒（Ad-PTEN）转染对HASMCs细胞周期的影响,结果显示Ad-PTEN转染组G0/G1期细胞的比例显著大于Ad-GFP转染组与对照组（P＜0.05）,Ad-GFP转染组与对照组间差异无统计学意义（P＞0.05）。各组的S期及G2/M期细胞比例的差异无统计学意义（P＞0.05）。6、Western blot结果显示,各组细胞间总AKT水平差异无统计学意义（P＞0.05）,而Ad-PTEN转染组p-AKT蛋白表达水平显著低于Ad-GFP转染组和对照组（P＜0.05）,Ad-GFP转染组与对照组间差异无统计学意义（P＞0.05）。7、RT-PCR同时扩增Ad-PTEN转染组,Ad-GFP转染组和对照组P21 mRNA,结果显示Ad-PTEN转染组P21 mRNA的表达水平显著高于Ad-GFP转染组和对照组（P＜0.05）,Ad-GFP转染组与对照组间差异无统计学意义（P＞0.05）。结论1、通过腺病毒感染成功构建过度表达PTEN的原代培养气道平滑肌细胞模型,其能有效地引起气道平滑肌细胞内过度表达PTEN。2、通过腺病毒介导的气道平滑肌细胞内PTEN过度表达能够抑制气道平滑肌细胞的增殖,可提高人气道平滑肌细胞G0/G1期细胞的比例,阻滞细胞周期进程。3、通过腺病毒介导的气道平滑肌细胞内PTEN过度表达能够对PI3K/PKB/AKt信号通路表现出抑制作用。4、通过腺病毒介导的气道平滑肌细胞内PTEN过度表达能够上调CDK抑制因子p21的表达进而阻滞细胞周期进程。5、PTEN过表达能有效抑制人气道平滑肌细胞的增殖,其机制可能是通过对PI3K/PKB/AKt信号通路的抑制作用及上调P21的表达而起作用的。