双生病毒是世界范围内广泛发生的植物单链环状DNA病毒,已在许多国家的棉花、木薯、番茄、烟草等作物上严重危害,导致了很大的经济损失。作为细胞内专性寄生物,双生病毒的复制和移动完全依赖于寄主。为了抵抗双生病毒的入侵,植物进化出了多种防御机制。RNA沉默是一种序列特异性的基因调控过程,已被证明是植物抗双生病毒防御的主要机制之一,而双生病毒在与植物长期的竞争过程中,进化出相应的反制武器,如:自身基因组编码的蛋白质具有抑制这种RNA沉默的功能,也就是RNA沉默抑制子。桑花叶型矮缩相关病毒(Mulberry mosaic dwarf-associated geminivirus,MMDaV)是在中国桑树中发现的一种引起寄主呈现出花叶、矮化症状的单组份双生病毒。MMDaV基因组的正义链含有5个开放阅读框(V1、V2、V3、V4和V5)、互补链含有2个开放阅读框(C1和C2),但是这些蛋白的功能都尚不清楚。本论文鉴定了MMDaV编码的RNA沉默抑制子,并对其抑制RNA沉默的机理和亚细胞定位开展了以下研究:首先将MMDaV的病毒链和互补链编码的7个蛋白构建到35S启动子驱动的pCHF3载体上,通过农杆菌介导法将含有35S-GFP的农杆菌和MMDaV各个ORF的农杆菌共同浸润16c本氏烟叶片,发现在接种5天后35S-GFP与V2共同浸润的叶片在手提式紫外灯下能够表现出明显的绿色荧光,说明V2是一个局部RNA沉默抑制子。为了分析V2是否能够抑制双链RNA(dsRNA)诱导的RNA沉默,将35S-GFP、35S-dsGFP与V2共浸润,结果在共浸润的部位没有观察到GFP荧光,说明V2不能抑制dsRNA诱导的RNA沉默。为了解析参与V2抑制转录后基因沉默(Post-transcriptional Gene Silencing,PTGS)的关键基序,在序列分析发现V2中含有F-box类似基序的基础上,构建了V2的F-box突变体,发现V2的F-box基序对于V2抑制PTGS是必需的。利用激光共聚焦显微镜分析了V2及其突变体的亚细胞定位,发现V2定位于细胞质、细胞核和核仁,而F-box突变后的V2不再定位于核仁,表明F-box对于V2在核仁中的定位是必需的。为了筛选参与V2抑制PTGS的寄主因子,通过酵母双杂交以及双分子荧光互补(BiFC)验证了V2与其候选互作蛋白NbSkp1.1的互作,并利用病毒诱导的基因沉默技术沉默了本氏烟中的NbSkp1.1基因,发现NbSkp1.1的沉默使得V2不再抑制PTGS,并且F-box的突变使得V2与NbSkp1.1的互作位点从细胞质、细胞核变为主要在细胞核。分析了MMDaV编码的V2蛋白的定位,发现V2蛋白在本氏烟的表皮细胞中瞬时表达时与核仁中的核仁蛋白纤维蛋白NbFib2共定位。通过酵母双杂交实验与BiFC实验证实了V2与NbFib2的互作。比较了MMDaV侵染状态下V2的亚细胞定位,发现MMDaV的存在使V2蛋白从核仁转移到核质,而且MMDaV编码的RepA(replication-associated protein A)与V2互作,使得V2以及V2自我互作位点都从核仁中排除,并且进一步发现RepA可能通过将NbFib2-V2复合物从核仁排除到核质从而促使V2从核仁中排出。