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木薯（Manihot Esculenta Cranz）是大戟科（Euphorbiaceae）木薯属（Manihot）灌木状多年生植物,属于重要的粮饲兼用型作物和能源作物,具有耐旱和耐贫瘠的优良特性。世界木薯主栽区位于南北回归线之间的热带和亚热带地区,在长期进化过程中木薯适应了温暖气候,对低温敏感。随着人们对木薯产品需求增加,木薯产业飞速发展,促进木薯栽培向北移植,扩大木薯种植面积,是达到缓解木薯产品短缺相对最有效的手段之一,这就对木薯品种的耐寒性提出了要求。研究木薯低温胁迫响应分子调控机制,能够为培育抗寒木薯新品种奠定基础。本研究利用转录组数据,结合qRT-PCR技术,对木薯MYB转录因子家族成员的表达模式进行了分析,筛选低温胁迫相关的MeMYB基因。利用遗传转化体系,获得了MeMYB2的RNAi木薯转基因株系并从其对低温的耐受性差异出发,深入探讨了MeMYB2介导木薯响应低温胁迫的分子机理,主要研究结果如下:1.本研究筛选到299个候选木薯MYB家族成员,并将其分为四个亚家族:R2R3-MYB;1R-MYB/MYB-related;3R-MYB和4R-MYB。125个MeMYBs在对低温耐受性不同的栽培种SC124（国内选育品种）和Arg7（耐低温品种）中表达模式差异很大。142个MeMYBs在两个材料中的表达模式一致。MeMYB2在SC124中响应低温,而在转基因受体材料cv.60444（低温敏感）中却不响应。2.转基因木薯具有较强低温耐受性。利用农杆菌介导的木薯遗传转化技术体系创制了2个独立的单拷贝MeMYB2基因沉默株系2i-17和2i-202。低温（4°C）胁迫下表型分析发现,转基因株系具有较强的生存率。早期低温胁迫下,转基因木薯叶片中相对电导率（Relative conductance,RC）、丙二醛（Malondialdehyde,MDA）、过氧化氢（H2O2）、超氧阴离子O2-（Oxygen free radical,OFR）显著低于野生型;而叶绿素荧光（Photochemical efficiency of photosystem II,Fv/Fm）、脯氨酸（Proline）含量显著高于野生型;转基因木薯和野生型木薯叶片中茉莉酸（Jasmonic Acid,JA）、茉莉酸异亮氨酸（Jasmonate isoleucine,JA-Ile）积累方式存在明显的差异,而脱落酸（Abscisic acid,ABA）含量和积累方式无显著差异。3.花青素可以有效清除过量ROS并提高转基因木薯低温耐受性。类黄酮和花青素靶向代谢组学发现,转基因木薯顶芽中显著积累的红色代谢物正是矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-glucoside,属花青素类）,而野生型中则没有该代谢产物积累。野生型木薯外喷花青素后,在低温胁迫下顶芽被花青素保护,而对照组现了不同程度的萎蔫或死亡,处理组叶片RC、SOD、CAT和APX的活性显著低于对照组,而Fv/Fm、Pro含量则显著高于对照组。4.MeMYB2是低温下木薯花青素积累的负调控因子。转录组数据对差异表达基因进行KEGG富集分析发现,MAPK信号通路、类黄酮生物合成及植物与病原菌互作通路等途径存在显著差异。在早期低温胁迫下,干涉转基因木薯中花青素合成通路（Me CHS、Me CHI、Me F3H、Me F3’H、Me F3’5’H、Me DFR、Me ANS）和原花青素合成通路（Me LAR、Me ANR）的基因都显著上调,而这些基因在野生型木薯中则不响应低温。qRT-PCR分析结果与转录组数据一致。5.MeTT8是低温下转基因木薯叶片中积累花青素的重要调控因子。组织特异性表达分析发现,MeTT8主要在叶片中表达。MeTT8具有典型的HLH DNAbinding结构域,属于b HLH家族,定位在细胞核中。低温能显著诱导转基因木薯中MeTT8上调表达,而野生型中MeTT8不响应低温。酵母单杂交、EMSA和萤火虫素酶互补实验证明,MeMYB2能结合MeTT8的启动子,并抑制MeTT8的表达;MeTT8能结合到二氢黄酮醇4-还原酶（Me DFR）的启动子上,并显著激活Me DFR表达。6.通过病毒介导的基因沉默技术（virus-induced gene silencing,VIGS）将转基因木薯中MeTT8下调表达,在早期低温胁迫下,MeMYB2-RNAi-MeTT8-VIGS（2i-MeTT8-VIGS）株系中花青素含量显著降低,而MeMYB2-RNAi转空载体对照（2i-blank）中花青素含量显著升高。在低温下,2i-blank株系中Me DFR的表达显著上调,而在2i-MeTT8-VIGS株系中Me DFR的表达受到了抑制。综上所述,下调表达MeMYB2后,低温能诱导MeTT8表达并激活Me DFR的表达,来促进花青素积累,清除过量活性氧,进而提高转基因木薯MeMYB2-RNAi的低温耐受性。本研究在一定程度上解析了木薯低温敏感的机理,并创制了低温耐受性强的MeMYB2-RNAi木薯转基因种质,为木薯北移提供了理论支持。