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木质纤维素作为自然界最丰富的可再生资源之一,将其转化为生物燃料和高值化学品是解决能源和环境危机的重要途径,同时也可为农业世界带来新的机遇。在自然界中有许多丝状真菌能分泌较完整的木质纤维素降解酶系,而且具有较高的产酶水平,因此它们被广泛应用于工业纤维素酶的生产;其中草酸青霉因其木质纤维素水解酶系统组成更加齐全多样、比例更合理而成为生产纤维素酶的重要工业菌株。构建高产木质纤维素降解酶的草酸青霉菌株是降低纤维素酶的生产成本、促进木质纤维素燃料产业化的一种重要途径,其中所运用的构建手段大多是聚焦在提高纤维素酶基因的表达水平,而对菌株分泌系统的研究却很少;同时蛋白质过高的表达也会给菌株分泌系统带来压力,形成限制蛋白质高产的瓶颈,因此对草酸青霉的分泌系统进行研究是构建纤维素酶高产菌株所必需的。丝状真菌中纤维素酶的分泌途径主要是经典内质网/高尔基体依赖性分泌途径,分泌途径中限制蛋白高效分泌的几个重要节点包括蛋白的易位和折叠、蛋白的膜泡运输、蛋白的分选等,本论文基于草酸青霉中这几个重要的分泌节点,对与纤维素酶分泌相关的关键蛋白进行了发掘,这对提高纤维素酶分泌、构建能适应纤维素酶高表达水平的高效分泌纤维素酶的底盘菌株具有重要的研究意义。本论文的主要研究内容和结果如下:1.参与纤维素酶易位和折叠过程的关键分泌元件的发掘根据文献报道,里氏木霉SEC61蛋白、酿酒酵母Srp14p蛋白、酿酒酵母Srp54p蛋白、酿酒酵母Ssa1p蛋白为参与蛋白易位过程的分泌元件;里氏木霉BIP1蛋白、黑曲霉LHS1蛋白、里氏木霉PDI1蛋白、黑曲霉HACA蛋白为参与蛋白折叠过程的分泌元件。将这些分泌元件的氨基酸序列逐一与草酸青霉114-2基因组进行同源比对,将比对到的最佳同源蛋白分别命名为pSEC61、pSrp14、pSrp54、pSsa1、pBIP1、pLHS1、pPDI1、pHACA,根据较高的氨基酸序列相似度以及相似的蛋白二级结构,我们推测比对到的蛋白与文献报道的蛋白具有相似或一致的功能。利用构巢曲霉组成型强启动子PgpdA构建了psec61、psrp14、psrp54、pssa1、pbip1、phs1、ppdi1过表达菌株,同时构建了phacAi持续激活过表达菌株,对构建的过表达菌株的纤维素酶酶活力和纤维素酶关键基因转录水平进行分析后我们发现,OEpsrp14、OEpbip1和OEphacAi菌株在没有明显改变菌株纤维素酶表达水平的情况下显著提高了菌株纤维素酶酶活水平,尤其是FPA、pNPC酶活水平。这表明pSrp14、pBIP1和pHACA可能在草酸青霉纤维素酶易位和折叠过程中发挥着比较重要的作用。2.内质网-高尔基体间膜泡运输中关键分泌元件的发掘根据文献报道,粗糙脉胞菌Erp1p蛋白、粗糙脉胞菌Emp24p蛋白、粗糙脉胞菌Erv29p蛋白、米曲霉AoVip36蛋白、米曲霉AoEmp47蛋白为参与内质网-高尔基体间膜泡运输过程的分泌元件。将这些分泌元件的氨基酸序列逐一与草酸青霉114-2基因组进行同源比对,将比对到的最佳同源蛋白分别命名为pErp1、pEmp24、pErv29、pVip36、pEmp47,根据较高的氨基酸序列相似度以及相似的蛋白二级结构,我们推测比对到的蛋白与文献报道的蛋白具有相似或一致的功能。利用构巢曲霉组成型强启动子PgpdA构建了perp1、pemp24、perv29、pvip36 过表达菌株,同时构建了pemp47基因敲除菌株,对构建的过表达菌株和敲除菌株的纤维素酶酶活力和纤维素酶关键基因转录水平进行分析后我们发现,Δpemp47菌株在没有明显改变其本身的纤维素酶表达水平的情况下显著提高了其纤维素酶酶活水平,这表明pEmp47可能在草酸青霉纤维素酶由高尔基体向内质网的反向转运过程中发挥着关键作用。3.高尔基体与质膜间膜泡运输及液泡分选过程中关键分泌元件的发掘根据文献报道,酿酒酵母SSO1蛋白、酿酒酵母RHO3蛋白、酿酒酵母SNC2蛋白、酿酒酵母SEC4蛋白、酿酒酵母YPT32蛋白为参与高尔基体与质膜间膜泡运输过程的分泌元件;米曲霉AoVps10蛋白、粗糙脉胞菌NcAp3b蛋白、粗糙脉胞菌NcAp3m蛋白为参与液泡分选过程的分泌元件。将这些分泌元件的氨基酸序列逐一与草酸青霉114-2基因组进行同源比对,将比对到的最佳同源蛋白分别命名为 pSSO1、pRHO3、pSNC2、pSEC4、pYPT32、pVps10、pAp3b、pAp3m,根据较高的氨基酸序列相似度以及相似的蛋白二级结构,我们推测比对到的蛋白与文献报道的蛋白具有相似或一致的功能。利用构巢曲霉组成型强启动子PgpdA构建了psso1、prho3、psnc2、psec4、pypt32 过表达菌株,同时构建了pvps10、pap3b、pap3m基因敲除菌株,对构建的改造菌株的纤维素酶酶活力和纤维素酶关键基因转录水平进行分析后我们发现,OEpsnc2和OEpsec4过表达菌株及Δpvps10敲除菌株在没有明显改变菌株的纤维素酶表达水平的情况下显著提高了其纤维素酶酶活水平。这表明pSNC2、pSEC4可能在草酸青霉纤维素酶由高尔基体向质膜的囊泡转运过程中发挥着关键作用,pVps10可能在草酸青霉纤维素酶被错误分选降解的过程中发挥着重要的作用。