引导骨再生技术(Guided Bone Regeneration,GBR)是指在骨缺损处,利用生物屏障膜维持成骨所需的空间,阻挡增殖较快的周围纤维结缔组织过早长入,保证增殖速度较慢的成骨细胞和血管的生长,从而促进骨组织修复再生。但是目前所用的生物膜仅有屏障作用而缺乏骨诱导作用。因此,研究开发具有成骨诱导性的生物膜材料对于修复口腔颌面部局部骨缺损具有重要的临床意义。生物玻璃(Na2O-CaO-SiO2-P2O5 Bioglass)指一种能实现特定的生物、生理功能的材料,在骨缺损处植入生物玻璃,微观下可观察到其能与骨组织产生结合,修复缺损的骨组织,恢复骨组织功能。生物玻璃促骨再生的机制是其降解过程中的产物和游离出来的离子可调节成骨细胞的骨钙蛋白(osteocalcin)、骨黏连蛋白(osteonectin)、骨桥蛋白(osteopontin) mRNA的表达,这些蛋白在促进细胞增殖、细胞代谢和细胞间连接等方面具有重要的作用,同时增强成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)的活性,有利I型胶原产生,促骨组织的形成,生物玻璃相对其他常见的人工骨充填材料如羟基磷灰石等具有更高成骨效率。当生物玻璃与无机材料、有机材料或其他高分子材料共同复合时,可产生性能显著的生物复合高分子材料。这种复合材料在组织工程学、器官填充和缺损修复等方面已广泛运用。聚乳酸(poly-1-lactic acid PLLA)是一种新型的生物降解材料,来源广泛,无细胞毒性,机械性能及物理性能良好,生物相容性与可降解性良好,良好的抗拉强度及延展度的优点,是当前医学上应用最多的合成可降解聚合物之一。但其降解产物偏酸性,易在体内引起无菌性炎症反应,由于聚乳酸整体化学结构上缺乏反应性官能基团,不具备亲水性能,导致其弱细胞黏附性。因此本课题设想将生物玻璃与聚乳酸复合,正是利用了二者各自优势,结合两者,目的在于突破目前临床生物膜的局限,不仅仅局限在屏障作用,同时具备与更好的生物相容性、机械物理性能和可降解性,更重要在于具备骨诱导作用。低温氧等离子技术表面改性技术在材料表面引入羟基、羧基等含氧极性功能团(fanctional group),许多研究认为引入羟基、羧基等极性功能基团,可有效改善材料表面的亲水性,有利于细胞附着,从而达到改变材料表面性质的目的,采用这种技术可以保证材料制备的稳定及可控性,在不影响材料的基本结构的前提下,同时不存在化学制剂的残留,影响整体材料的生物相容性。其一定程度上改善生物材料表面的亲水性能,已成为促进细胞附着生长于材料表面的一个重要方法。本课题组选用生物玻璃与聚乳酸,通过热致相分离法制备成新型的复合膜,正是利用了二者各自优势,聚乳酸本身良好机械性能及物理性能,相容性与可降解性良好,良好的抗拉强度及延展度弥补生物玻璃的缺陷,而且聚乳酸材料表面缺少细胞识别位点,生物玻璃可作为细胞识别位点,增强细胞在其表面上的黏附和增殖,同时生物玻璃缓冲聚乳酸在降解过程中的酸性产物。进而通过低温等离子技术对聚乳酸表面进行改性,可在不影响聚乳酸自身材料特点的前提下,改善聚复合膜表面的亲水性、黏结性和生物相容性,.使细胞更易于黏附与材料表面。对其表观,理化性能和生物相容性进行检测。经文献检索,国内外尚无相同的研究报道。第一部分低温氧等离子处理聚乳酸/生物玻璃引导骨再生膜的制备与表征检测目的制备新型的亲水性的聚乳酸／生物玻璃引导骨再生膜,并考察复合膜的表观形态、孔隙率,分析其亲水和力学拉伸物理性能。方法1.按聚乳酸和生物玻璃的质量比为9：1,通过热致相分离法制备得所需要的聚乳酸-生物玻璃复合膜,再进行低温氧等离子处理改性,得到表面富含氧极性官能团的聚乳酸-生物玻璃引导骨再生膜。2.对材料整体形态研究。3.对复合膜表面形态分析,采用JSM-6330F冷场扫描电子显微镜分别对喷金后PLLA/BG复合膜进行表面形貌分析。并采用Photoshop软件。用其测量膜结构纤维的直径和孔隙大小4.对复合膜孔隙率的测定,利用液体(无水乙醇)置换法测得。比重瓶中装满乙醇后的质量为W1(g),把质量为Ws(g)的样品浸入装乙醇的比重瓶中脱气。使乙醇充盈于多孔膜材料的孔中。复添加满乙醇,此时装有样品和乙醇的比重瓶质量为W2(g)。取出充满乙醇的样品后,剩余的乙醇与比重瓶质量为W3(g)。复合膜的孔隙率计算公式如下：P代表材料的孔隙率(%)；V0代表材料在自然状态下的体积,或称表观体积(cm3)；V代表材料的绝对密实体积(cm3)5.对复合膜的水接触角度测试,采用OCA15表面接触角分析仪测定样本的表面接触角,在每个标本的3个不同位置滴双蒸水10μL,读取接触角并取平均值。6.对复合膜的力学拉伸测试,将材料裁制.40 mm×5 mm×2 mm矩形样条,夹持在自制的两片细砂纸框架中,再装载于力学测试仪,以3 mm/min将支架往两侧拉伸,在室温环境下对样品进行测试,每个样品测试5个平行样。结果1.从复合膜整体表面上观察,膜呈白色或淡黄,不平整。本研究制备的膜材料直径大小约为1.5 cm,高度约为2 mm,其具有压缩性。2. 本实验制备的纯PLLA膜为纳米级纤维多孔连通结构,孔隙直径大小约为1～4μm,聚乳酸纤维直径约为160-320nm,当PLLA与BG的质量比为9：1时,BG颗粒能够较好地吸附在PLLA基质中,整体分散结合在纳米级纤维支架内,可观察到BG/PLLA膜的纤维直径及孔隙与PLLA膜相比未见明显变化,不影响材料的结构及连通性。3.纯聚乳酸膜材料的孔隙率高达93.926%,加入BG的PLLA/BG复合膜无论是否经过氧等离子处理的两组膜孔隙率相对降低,分为93.048±0.121%和93.046±0.145%,基本不会影响膜材料的整体结构。3组屏障膜材料均具有较高的孔隙率。4.表面接触角分析仪示PLLA膜的水接触角度为1 18.85°±5.88。,未经处理的PLLA/BG复合膜的水接触角度为99.42°±5.86。,经过氧等离子处理后的PLLA/BG复合膜的水接触角度为81.32±5.77。,其差异存在统计学意义,这表明经过氧离子处理后的PLLA/BG膜其亲水性能明显得到改善。5.力学拉伸测试示PLLA膜的拉伸强度可达34.6±1.5MPa,未经处理的PLLA/BG复合膜的拉伸强度达27.1±1.4 MPa,经过氧等离子处理后的PLLA/BG复合膜的拉伸强度达20.8±2.]MPa,在复合膜中加入生物玻璃可能影响聚乳酸的规整性,阻碍结晶,降低结晶度,导致强度下降,经氧等离子处理材料的拉伸强度仍可保持20 MPa以上,可能由于氧离子处理过程中造成材料表面刻蚀,导致拉伸强度下降,较PLLA或未处理PLLA/BG材料均有明显下降。结论本研究所制备的PLLA/BG引导骨再生膜具有纳米纤维状三维网络结构,生物玻璃散在分布在支架内部。具有良好的孔隙率,具有亲水性,在力学拉伸试验中表现出一定抗拉伸性能的特点,证明膜构成稳定。第二部分低温氧等离子处理聚乳酸/生物玻璃引导骨再生膜的细胞生物相容性研究目的检测氧等子处理聚乳酸/生物玻璃引导骨再生膜的生物相容性及是否具备促成骨性能方法1.检测复合膜上MG63细胞细胞黏附率,接种100 μL密度为1×10。的细胞悬浮液于24孔板内已预湿的三组膜(PLLA膜、PLLA/BG膜、经氧等离子处理PLLA/BG膜)。接种后1 h、3 h、6 h分别测定实验组和对照组的细胞黏附率,每组每次取出3孔,吸出培养基,计算培养液中的细胞数目(A1),取出材料后,对该孔贴孔壁细胞消化,计数为(A2)。(其中A0为接种细胞数)按以下公式：细胞黏附率(Adhesion rate)=[(A0-A1-A2)/A0]×100%2. Hoechst染色检测复合膜上MG63细胞黏附能力,将接种100gL密度为5×10。的MG63细胞悬液于24孔板内已预湿的三组膜(PLLA膜、PLLA/BG膜、经氧等离子处理PLLA/BG膜)。分别培养1 h,3h,6h后取出,PBS漂洗,加入4%多聚甲醛固定10mim,反复PBS漂洗,滴加10μg/ml的Hoechst液体3001μL,于室温孵育30min, PBS冲洗,滤纸吸去表面残留PBS液体,立即入荧光显微镜下观察。3.检测复合膜上MG63细胞增殖率,接种100μL密度为5×10。细胞悬浮液,于24孔板内已预湿的三组膜(PLLA膜、PLLA/BG膜、经氧等离子处理PLLA/BG膜),分别于1d、3d、5d,取出材料,漂洗,移入新24孔板,加入新鲜培养基300 u1后避光加入MTS 60μL,置入37℃恒温箱孵育3 h后,每孔取2次,每次取100μL加入96孔板,置于酶标仪内于波长为490 nm处测量各孔吸光度值(OD值)。4.SEM电镜扫面观察复合膜上MG63细胞形态及钙化结节,将预湿氧等离子处理_PLLA/BG复合膜置于24孔板内,接种100μL密度为1×10。的MG63细胞悬液。分别培养3d、7d后弃培养基,用2.5%戊二醇4。C固定过夜；梯度乙醇溶液逐级脱水；喷金；扫描电子显微镜下观察在样本表面的黏附、增殖及钙化结节形成状态。5.接种1 00gL密度为5×10。的MG63细胞悬液于24孔板内已预湿的三组膜(PLLA膜、PLLA/BG膜、经氧等离子处理PLLA/BG膜),置于孵育箱中培养3d、7d、14d,用PBS荡洗3次,每孔加入200μL 1%Triton X-100,静置于4。C冰箱裂解10-15h,每孔取30μL加入96孔板中,按照碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒操作说明依次加入各试剂后,使用酶联免疫检测仪在520nm波长下测定各孔吸光值(OD值)[19]。结果1.随细胞接种时间的延长,3组膜的细胞粘附率均有增高,其中PLLA与未处理PLLA/BG两组膜在三个时间点其细胞粘附率差异不存在统计学意义(P>0.05),经氧等离子处理的复合膜粘附率高于其他两组,差异均有统计学意义。2. 由Hoechst染色染色结果示MG-63细胞在三组膜上的黏附增殖情况存在明显差异,由于PLLA表面的疏水性,导致1h和3h时仅有极少量的细胞黏附在PLLA膜或PLLA/BG膜表面,经过氧等离子处理PLLA/BG膜在早期明显促进细胞黏附,在三组材料的第一个时间点(1h)镜下可见细胞内的细胞核染蓝色荧光,细胞散在分布,3h时荧光量增加,而6h时MG63细胞在各组膜的黏附率均增高,经氧等离子处理的复合膜上荧光量显著增加。3.随细胞接种时间的延长,3组膜的细胞增殖率均有提高,其中经过氧等离子处理PLLA/BG膜细胞增殖率在三个时间点均高于PLLA膜或未处理PLLA/BG膜,差异有统计学意义(P<0.01),未处理PLLA/BG膜与PLLA膜细胞增殖率差异不存在统计学意义。4.扫描电镜下可见在氧等离子处理PLLA/BG复合膜上培养3d后,MG63细胞呈梭形、多边形,黏附于膜表面,丝状伪足开始向各方向伸展,与复合膜相互紧密交联,可见细胞胞浆丰富。经7d培养后,细胞总体数量明显增多,并生发生迁移汇合,呈片状生长趋势,覆盖叠层,见细胞钙化基质数量逐渐增多沉淀。细胞覆盖汇合呈片状或鳞状后,整体增殖减缓,开始分泌细胞钙化基质。由于细胞覆层叠盖,导致细胞间分界在电镜下观察模糊,因此在低倍数电镜下观察可见数个呈片状或鳞状细胞团块与膜三维网状支架交联,散在独立分布,细胞团块外周可见细胞突起相互缠绕,并可见细胞分泌球形状的钙化基质,这些分泌的细胞钙化基质发生矿化后,形成钙化结节。5.MG63细胞在三组膜上的ALP活性总体趋势呈随时间推移先增高后降低,在第7天达峰值。在第三天检测结果示：加入BG的两组复合膜的OD值均高于PLLA膜组,其差异具有统计学意义(P<0.01)。在另外两个时间点检测,三组膜的OD值之间不存在统计学意义。结论经实验证明,本研究所制备的PLLA/BG引导骨再生膜可促细胞黏附,具有良好的生物相容性及具备促成骨细胞形成钙化基质。