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本文利用限制酶切多态与RAPD结合改进的创新方法(RestrictionFragment-Random Amplified Polymorphic DNA,RF—RAPD)对十株杜氏藻(七株已定种,即四株Dunaliella salina及D bardawil、D.primolecta、D.parva和三株未定种,D.sp76、D.sp80、D.sp85)进行了遗传多样性分析。从28个引物中筛选出22个可获得清晰条带的引物,共扩增出190条带,其中多态性条带185条。根据Nei聚类分析,10株盐藻可归为三类:D.salina的两个北京品系(D.salina OUC2和D.salina OUC3)为种内差异并与以色列品系(D.salina OUC4)归为一组,D.sp76和D.sp80亲缘关系较近,并与D.salina OUCl、D.bardawil归为一组,D.primolecta、D.parva及D.sp85归为一组。D.salina OUC2、D.salina0UC3、D.salina OUC4属于D.salina的不同品系,但在聚类图上与另一D.salinaOUCl品系亲源关系较远,其遗传距离大于不同种间的,推测是由于遗传变异所致。D.salina OUC2、D.salina OUC3、和D.salina OUC4之间的差异条带可以开发作为筛选B一胡萝卜素累积特征及含量相关性分子标记。
选取类胡萝卜素合成过程中的关键酶一八氢番茄红素脱氢酶(Phytoenedesaturase,PDS),根据相近物种pds基因序列设计兼并引物,提取纯化培养杜氏盐藻(Dunaliella salina)细胞RNA,反转录为cDNA,利用RT-PCR方法获得pds基因部分序列,测序,鉴定。根据已得序列,设计引物,采用RACE的方法分别获得5’端和3’端序列,根据所得结果拼接得到pds基因2290bpcDNA全长,序列全长包括21bp的5’端非编码区和520 bp 3’端非编码区,提交到GenBank数据库,序列登录号为DQ243892。通过己得cDNA序列,设计引物,以PCR和invitro cloning方法共得到2908bp长的DNA序列,包括5个内含子,序列登录号为DQ845248。对序列信息进行了详细的分析, Southern blotting结果显示pds基因在杜氏盐藻基因组中存在一个拷贝,应用半定量RT-PCR的方法对该基因在藻生长过程的各个阶段的表达情况进行了分析。探讨了电激转化盐生杜氏藻的条件,并实现了质粒pBI211-cat的瞬时表达。采用了两种电激模式-高电压低电容模式下3-7 kV/cm和低电压高电容模式下300-500 V/cm,对盐生杜氏藻细胞转化质粒后,从多个方面动态检测了转化效果。实验组细胞数量与对照组于第四天起有差异,实验组活细胞数量多于对照组(p<0.05),未加质粒的对照组第16天细胞存活很少,20天后完全死亡,加质粒的实验组死亡速度明显慢于对照组(p<0.05);转化后16天内实验组细胞PCR扩增检测cat基因部分序列结果呈阳性;组织化学染色法检测GUS基因表达,有蓝色反应;由此推断,质粒pBI221-cat在盐生杜氏藻中表达,因此具有氯霉素抗性并表达β-葡糖苷酸酶。转化实验组盐生杜氏藻细胞24天后最终全部死亡,说明表达为瞬时,PCR和GUS组织染色也证明质粒的存在和表达为瞬时。为下一步在盐生杜氏藻中实现以RNAi的方法研究基因功能提供实验基础。
在前面工作基础之上,pBl221-cat为基础,插入正反向重复序列,构建表达双链RNA的RNAi表达载体。首先在载体pBI221-cat的SmaI和Bspl407I单酶切位点之间插pds基因328bp的正向片段和368bp间隔序列,得到中间载体pBIRNAI-Ds,鉴定正确之后插入328bp反向序列。最后测序证明,表达载体pBIRNAI-Dsa构建成功。构建成功载体以电激的方法转入盐藻细胞,以非双链表达载体pBl221-cat为对照,荧光实时定量PCR的方法测定电激后pds基因的表达,以2-<△△CT>法来处理数据,表示目的基因的表达相对改变量。数据显示,较转入对照载体pBI221-cat的对照组而言,转入干涉载体pBIRNAI-Dsa的实验组pals基因表达显著下降,说明pds基因的表达受到抑制。在杜氏盐藻中建立以RNAi研究基因功能的方法,为有效研究其耐盐机制提供快速有效工具。