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本文利用限制酶切多态与RAPD结合改进的创新方法(RestrictionFragment-Random Amplified Polymorphic DNA，RF—RAPD)对十株杜氏藻(七株已定种，即四株Dunaliella salina及D bardawil、D.primolecta、D.parva和三株未定种，D．sp76、D．sp80、D．sp85)进行了遗传多样性分析。从28个引物中筛选出22个可获得清晰条带的引物，共扩增出190条带，其中多态性条带185条。根据Nei聚类分析，10株盐藻可归为三类：D．salina的两个北京品系(D.salina OUC2和D．salina OUC3)为种内差异并与以色列品系(D．salina OUC4)归为一组，D．sp76和D．sp80亲缘关系较近，并与D．salina OUCl、D．bardawil归为一组，D．primolecta、D．parva及D．sp85归为一组。D.salina OUC2、D．salina0UC3、D．salina OUC4属于D．salina的不同品系，但在聚类图上与另一D．salinaOUCl品系亲源关系较远，其遗传距离大于不同种间的，推测是由于遗传变异所致。D．salina OUC2、D．salina OUC3、和D．salina OUC4之间的差异条带可以开发作为筛选B一胡萝卜素累积特征及含量相关性分子标记。
选取类胡萝卜素合成过程中的关键酶一八氢番茄红素脱氢酶(Phytoenedesaturase，PDS)，根据相近物种pds基因序列设计兼并引物，提取纯化培养杜氏盐藻(Dunaliella salina)细胞RNA，反转录为cDNA，利用RT-PCR方法获得pds基因部分序列，测序，鉴定。根据已得序列，设计引物，采用RACE的方法分别获得5’端和3’端序列，根据所得结果拼接得到pds基因2290bpcDNA全长，序列全长包括21bp的5’端非编码区和520 bp 3’端非编码区，提交到GenBank数据库，序列登录号为DQ243892。通过己得cDNA序列，设计引物，以PCR和invitro cloning方法共得到2908bp长的DNA序列，包括5个内含子，序列登录号为DQ845248。对序列信息进行了详细的分析， Southern blotting结果显示pds基因在杜氏盐藻基因组中存在一个拷贝，应用半定量RT-PCR的方法对该基因在藻生长过程的各个阶段的表达情况进行了分析。探讨了电激转化盐生杜氏藻的条件，并实现了质粒pBI211-cat的瞬时表达。采用了两种电激模式-高电压低电容模式下3-7 kV/cm和低电压高电容模式下300-500 V/cm，对盐生杜氏藻细胞转化质粒后，从多个方面动态检测了转化效果。实验组细胞数量与对照组于第四天起有差异，实验组活细胞数量多于对照组(p<0.05)，未加质粒的对照组第16天细胞存活很少，20天后完全死亡，加质粒的实验组死亡速度明显慢于对照组(p<0.05)；转化后16天内实验组细胞PCR扩增检测cat基因部分序列结果呈阳性；组织化学染色法检测GUS基因表达，有蓝色反应；由此推断，质粒pBI221-cat在盐生杜氏藻中表达，因此具有氯霉素抗性并表达β-葡糖苷酸酶。转化实验组盐生杜氏藻细胞24天后最终全部死亡，说明表达为瞬时，PCR和GUS组织染色也证明质粒的存在和表达为瞬时。为下一步在盐生杜氏藻中实现以RNAi的方法研究基因功能提供实验基础。
在前面工作基础之上，pBl221-cat为基础，插入正反向重复序列，构建表达双链RNA的RNAi表达载体。首先在载体pBI221-cat的SmaI和Bspl407I单酶切位点之间插pds基因328bp的正向片段和368bp间隔序列，得到中间载体pBIRNAI-Ds，鉴定正确之后插入328bp反向序列。最后测序证明，表达载体pBIRNAI-Dsa构建成功。构建成功载体以电激的方法转入盐藻细胞，以非双链表达载体pBl221-cat为对照，荧光实时定量PCR的方法测定电激后pds基因的表达，以2-<△△CT>法来处理数据，表示目的基因的表达相对改变量。数据显示，较转入对照载体pBI221-cat的对照组而言，转入干涉载体pBIRNAI-Dsa的实验组pals基因表达显著下降，说明pds基因的表达受到抑制。在杜氏盐藻中建立以RNAi研究基因功能的方法，为有效研究其耐盐机制提供快速有效工具。