【摘 要】
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随着科技的进步和生活水平的提高,人们对于克隆宠物的需求日益增多。在很多发达国家,狗和猫的克隆已经实现商业化,并展现出巨大的市场前景。而我国牛羊猪等家畜的体细胞克隆技术虽已较为成熟,但在狗和猫等宠物上的研究仍较少,且由于物种差异,狗和猫的克隆体系在很多技术环节上仍需要针对性的改进。卵母细胞体外成熟效率低是目前影响猫克隆效率的关键因素之一。本研究针对猫卵母细胞体外最佳成熟时间难以确定及卵母细胞胞质内脂
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目（编号:31972572）；
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随着科技的进步和生活水平的提高,人们对于克隆宠物的需求日益增多。在很多发达国家,狗和猫的克隆已经实现商业化,并展现出巨大的市场前景。而我国牛羊猪等家畜的体细胞克隆技术虽已较为成熟,但在狗和猫等宠物上的研究仍较少,且由于物种差异,狗和猫的克隆体系在很多技术环节上仍需要针对性的改进。卵母细胞体外成熟效率低是目前影响猫克隆效率的关键因素之一。本研究针对猫卵母细胞体外最佳成熟时间难以确定及卵母细胞胞质内脂滴多易发生氧化应激这两个猫克隆技术中亟待解决的问题,着重研究了猫卵母细胞体外培养时间和半胱氨酸、半胱胺对家猫卵母细胞体外成熟的影响。一、为探究猫卵母细胞最佳培养时间,本试验设计的时间梯度为24 h、26 h、28 h、32 h和36 h。观察各组卵母细胞第一极体排出情况,通过荧光染色观察记录不同核型,从而确定卵母细胞核体外最佳成熟时间,并进行孤雌激活,进一步验证卵母细胞的后续发育情况,结果如下:（1）体外成熟培养时间为36 h时,发育至MⅡ时期的卵母细胞的比例最高,达到67.92%;而培养时间为24 h时,占比仅为35.20%。培养时间为28 h、32 h、36 h时,发育至MⅡ时期的卵母细胞的比例分别为63.99%、65.50%、67.92%,无显著差异（p＞0.05）;28 h和32 h组退化率分别为6.70%、8.50%,无显著差异（p＞0.05）,36 h组退化率为11.32%,与其他组有显著差异（p＜0.05）。（2）不同时间组的卵母细胞进行孤雌激活,28 h组中的卵母细胞卵裂率和桑葚胚率均最高,分别为70.87%和48.54%,但与32 h组之间无显著差异（p＞0.05）;28 h组的囊胚率最高,达到33.98%,与32 h组间有显著差异（p＜0.05）;36 h组的激活率、桑葚胚率与囊胚率均最低,且与其他组间有显著差异（p＜0.05）。二、研究抗氧化剂半胱氨酸及半胱胺对猫体外培养卵母细胞的成熟效率和活性氧（ROS）水平、谷胱甘肽（GSH）含量、早期凋亡水平、线粒体活性、纺锤体形态及染色体排布的影响,结果如下:（1）半胱氨酸组（浓度:0 m M,0.1 m M,0.5 m M,1.0 m M）中,添加0.5 m M半胱氨酸时,发育至MⅡ阶段的卵母细胞比例最高,达46.29%;半胱胺组（浓度:0μM,50μM,100μM,200μM）中,添加100μM半胱胺时,卵母细胞成熟率最高,达63.99%。（2）添加0.5 m M半胱氨酸和100μM半胱胺后,家猫卵母细胞的ROS及GSH荧光强度显著降低（p＜0.05）。（3）添加0.5 m M半胱氨酸和100μM半胱胺后,分别有14.29%和10.61%的卵母细胞出现凋亡,对照组中有32.00%的卵母细胞出现凋亡,凋亡比例显著降低（p＜0.05）。（4）添加0.5 m M半胱氨酸和100μM半胱胺后,卵母细胞的线粒体荧光强度明显增强（p＜0.05）,且线粒体分布较为均匀。0.5 m M半胱氨酸组和100μM半胱胺组中的卵母细胞,出现纺锤体紊乱和染色体未对齐的卵母细胞的比例分别为14.67%和13.24%,显著低于对照组的24.29%（p＜0.05）。（5）0.5 m M和1 m M半胱氨酸组中的卵母细胞孤雌激活率较高,分别为67.62%和70.54%,无显著差异;0.5 m M半胱氨酸组中的卵母细胞桑葚胚率和囊胚率均最高,分别为40.00%和27.62%,且与其他组之间有显著差异（p＜0.05）。100μM和200μM半胱胺组中的卵母细胞孤雌激活率较高,分别为70.87%和73.39%,两组之间无显著差异（p＞0.05）;100μM半胱胺组中的卵母细胞桑葚胚率与囊胚率最高,分别为48.54%和33.98%,与其他组有显著差异（p＞0.05）。以上试验初步研究出家猫卵母细胞体外最佳培养条件为100μM半胱胺条件下培养28 h。选用此条件培养家猫卵母细胞,并进行体细胞核移植（SCNT）,结果如下:卵裂率、囊胚率、孵出率分别达到81.82%、39.68%和28.00%。综上所述,本研究表明猫卵母细胞体外最佳成熟培养时间为28h,添加0.5 m M半胱氨酸和100μM半胱胺均可以显著降低猫卵母细胞体外成熟中的氧化应激反应。
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