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目的： 研究HIF-1α对人结肠癌细胞血管新生因子VEGF、bFGF表达的影响，并探讨活血化瘀中药丹参的有效活性成分丹参酮IIA调控HIF-1α抑制结肠癌细胞血管新生的作用机制，以期从分子水平揭示缺氧对结肠癌血管新生的影响及丹参酮IIA抗结肠癌血管新生的机理，为临床上结肠癌靶向治疗提供实验依据。 方法： (1)通过慢病毒基因重组技术将人HIF-1α基因CDs序列插入慢病毒载体pGC-FUVector中，建立pGC-FU-HIF-1α重组慢病毒载体，RTPCR法检测病毒滴度。将该病毒载体感染人结肠癌HCT-116细胞，构建稳定过表达HIF-1α基因的HCT-116细胞，提取细胞株总RNA和蛋白，RTPCR和WesternBlot检测HIF-1α表达。 (2)构建HIF-1αRNAi质粒，RTPCR和WesternBlot筛选最佳干扰效果的质粒。ELISA法检测HIF-1α过表达或缺氧状态下干扰后对HCT-116细胞上清中血管生成促进因子VEGF、bFGF分泌水平的影响。CCK-8法测定HCT116条件培养基对HUVEC增殖影响，筛选最佳作用浓度。根据作用浓度，检测靶向HIF-1α干预后HCT116条件培养基对HUVEC体外管腔形成的影响。 (3)CCK-8法测定TanIIA对常氧及缺氧培养下HCT116细胞和常氧状态下HUVEC24、48和72h的生长抑制作用，并制定相应的TanIIA药物浓度范围。流式免疫荧光法检测TanIIA对CoCl2诱导的HIF-1α表达影响。ELISA法检测TanIIA对HIF-1α过表达或缺氧状态下干扰后HCT-116体外培养细胞上清中血管生成促进因子VEGF、bFGF分泌水平的影响。Tanswell和管腔形成实验检测TanIIA对HUVEC体外迁移和管腔形成的影响。 结果： (1)成功构建含HIF-1α慢病毒载体pGC-FU-HIF-1α，RTPCR及测序结果证明其DNA序列完全正确；建立稳定过表达HIF-1α的结肠癌细胞株，其HIF-1αmRNA表达是空白对照组的(4.185±0.221)倍，具有明显统计学意义(P<0.01)。阴性病毒感染组及空白对照组HIF-1α蛋白在常氧下未检测出，而pGC-FU-HIF-1α感染组在常氧下可检测出HIF-1α蛋白的表达。 (2)成功筛选出最佳的HIF-1αRNAi质粒GV248-SiHIF-1α-3＃，与其他靶点质粒相比具有统计学意义(P<0.05)。ELISA结果显示HIF-1α过表达能明显上调HCT116细胞上清中VEGF和bFGF因子的分泌；缺氧状态下靶向HIF-1α干扰后能显著下调HCT116细胞上清中VEGF和bFGF表达(P<0.01)。 (3)血管内皮细胞管腔形成实验表明HIF-1α过表达细胞条件培养基能较好的促进HUVEC管腔样结构的形成(P<0.01)。 (4)CCK-8法结果显示常氧及低氧下TanIIA呈时间和剂量依赖性抑制HCT116细胞生长，常氧下TanIIA的24h、48h和72hIC50值分别为30.7±1.52μM、13.3±0.56μM和5.1±0.55μM，低氧下TanIIA的IC50值分别为8.4±1.09μM、2.1±0.18μM和0.99±0，17μM；常氧下0.5-10μMTanIIA对HUVEC有较好的抑制作用，24、48和72h的IC50分别为1.77±0.24μM、0.9±0.05μM和0.37±0.08μM。 (5)流式免疫荧光检测结果显示TanIIA干预24h对CoCl2诱导的HIF-1α表达有明显的抑制作用(P<0.01)，随着TanIIA浓度的增加，HIF-1α表达逐渐降低，呈剂量-强度关系。 (6)ELISA结果显示TanIIA对HCT116细胞中VEGF、bFGF表达均具有抑制作用，呈剂量依赖性。TanIIA对CoCl2诱导的VEGF、bFGF表达也具有较强的抑制作用，中剂量组几乎完全抑制了CoCl2的诱导作用(P<0.01)。 (7)Tanswell和管腔实验结果也发现，TanIIA能抑制HUVEC细胞穿过Transwell小室PVPF膜，1μMTanIIA就有明显的抑制细胞迁移的作用(P<0.05)。TanIIA对10％FBS和20ng/mlVEGF所诱导HUVEC管腔的形成有较好的抑制作用。1.0μMTanIIA能抑制HUVEC管腔样结构的形成(P<0.01)。 结论： 1.成功构建HIF-1α，重组慢病毒载体pGC-FU-HIF-1α，建立稳定表达HIF-1α的结肠癌细胞株。 2.HIF-1α能上调结肠癌HCT116细胞中血管生成促进因子VEGF、bFGF的分泌，能诱导HUVEC管腔结构的形成，这可能是缺氧下肿瘤血管新生的机制之一。 3.TanIIA在缺氧培养条件下能显著抑制HCT116细胞的增殖，通过下调HIF-1α的表达，抑制缺氧介导的促血管生成因子VEGF、bFGF的分泌，并抑制血管内皮细胞的增殖、管腔形成和迁移，这可能是TanIIA抗血管生成的部分机制。