起源于细菌和古细菌的CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是近年来兴起的一种基因定点编辑技术,是继ZFN和TALEN之后的第三代编辑技术。该系统由单链引导RNA（single guide RNA,sg RNA）引导Cas（CRISPR-associated protein）蛋白对靶向序列进行特异性切割,Cas蛋白的两个结构域HNH和Ruv C分别切割DNA的两条链从而实现双链断裂（Double Strand Breaks,DSB）。双链断裂之后触发自身的修复系统,以同源重组（Homologous Recombination,HR）或非同源末端连接（Non-homologous End Joining,NHEJ）的方式修复,修复时如果发生错配则引发突变。该系统已经在拟南芥、玉米、棉花、小麦等多种植物中成功应用。葡萄是多年生高度杂合的木本果树,转基因周期较长,这给葡萄基因编辑技术发展带来了一定的阻碍。葡萄白粉菌作为一种专性寄生的活体营养型真菌,严重危害葡萄产量和品质。MLO（Mildew Resistance Locus O）基因是植物抗白粉病的负调控基因,在拟南芥和小麦等植物中敲除MLO基因后能显著提高它们对白粉菌的抗性。本研究利用CRISPR/Cas9技术定点编辑葡萄MLO基因,以期获得抗白粉病的mlo突变葡萄株系。主要结果如下:1.通过生物信息学分析,在葡萄中共鉴定出18个MLO基因（Vvi MLOs）。根据前人结果,从中筛选出四个对白粉病响应比较敏感的MLO基因Vvi MLO3、Vvi MLO6、Vvi MLO9、Vvi MLO12。从无核白葡萄中扩增出四个对葡萄白粉菌响应明显的MLO基因CDS序列。2.根据sgRNA识别的靶向位点的序列特征,在Vvi MLOs c DNA内筛选出高度特异的靶标序列。为了保证打靶的成功率,每个基因选出两个带有PAM（Protospacer Adjacent Motif）序列的靶向位点。将筛选出的靶标序列用Golden Gate克隆的方法与CRISPR/Cas9载体相连接,利用农杆菌介导的转化方法侵染无核白葡萄原胚团,经卡那霉素或除草剂筛选,获得抗性植株。再生株系成苗率低,畸形率高达93.33%。对获得的抗性植株提取叶片基因组DNA,用设计的特异引物进行PCR检测,扩增PCR阳性株系的靶向序列片段并进行一代测序,用DSDecode M解码分析测序结果。结果表明,葡萄MLO编辑植株的类型有纯合突变、双等位基因突变和杂合突变。CRISPR/Cas9介导产生的葡萄MLO变异主要以碱基的缺失和替换为主,杂合突变率为6%,双等位基因突变率为3%,纯合突变率为1%。在能够正常成苗的株系中,编辑效率约为10%。在不能够正常成苗的畸形苗中编辑效率为40%。正常成苗的编辑株系生长较弱,且有早衰现象。对编辑葡萄株系接种白粉菌,接种72 h后,台盼蓝染色观察,结果表明,编辑株系的菌丝长度比非转基因株系短,且在白粉菌入侵处产生细胞死亡,初步表明无核白葡萄mlo突变株可以在一定程度上提高其对白粉菌的抗性,但更多结果尚需进一步试验证实。