论文部分内容阅读
泛素-蛋白酶体系统的异常会导致多种人类疾病的发生,包括癌症、神经退行性疾病和免疫性疾病。截至目前,FDA已批准了3种蛋白酶体抑制剂用于治疗多发性骨髓瘤。蛋白酶体抑制剂的成功开发和临床使用证实了泛素-蛋白酶体系统作为抗肿瘤药物研发靶标的有效性。除了靶向蛋白酶体,靶向泛素偶联和去偶联过程中的关键参与蛋白也是有吸引力的药物研发策略。其中,针对去泛素化酶的相关研究也因此受到了越来越多的关注。去泛素化酶能够通过调控特定癌蛋白以及肿瘤抑制因子的生命周期和/或活性状态而参与细胞内多条肿瘤相关信号通路,影响肿瘤的疾病进程。USP2属于泛素特异性蛋白酶亚家族,近年来,在多种恶性肿瘤中都发现了USP2的高水平表达,与此同时,有研究指出USP2的过表达能够引起肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移,并导致肿瘤细胞对化疗药物的耐药性增强。迄今为止,仅有少量靶向USP2的小分子抑制剂被开发,它们对USP2的抑制活性多在中等强度范畴（微摩尔数量级）。因此,需要投入更多的力量以开发靶向USP2的具有新骨架结构的抑制剂以及具有优良活性和选择性的活性化合物。论文首先使用Ub-AMC水解抑制实验开展了靶向USP2催化结构域的抑制剂筛选工作,获得了活性化合物2个:抗肿瘤候选药物COH29和多酚类天然产物化合物13,随后分别在分子和细胞水平阐明了两个化合物的作用机制,明确了它们通过抑制USP2的活性发挥抗肿瘤作用。论文第一部分研究工作聚焦于由USP2活性抑制介导的抗肿瘤候选药物COH29的抗肿瘤分子机制研究。在针对商业化合物库开展的高通量筛选中,我们发现COH29能够显著抑制USP2的活性。COH29最初是由City of Hope癌症中心开发的人核糖核苷酸还原酶（RNR）抑制剂。本文研究结果表明COH29也可以与USP2结合并抑制USP2的去泛素酶活性,Ub-AMC水解实验测定COH29对USP2的抑制IC50值为2.02±0.16μM。除了单泛素化底物,COH29还能够抑制USP2催化水解不同连接种类的多聚泛素链,并抑制USP2-Ub-PA共价复合物的形成。后续实验中,我们通过蛋白质热转变稳定性实验、核磁共振实验（CPMG）和基于COH29偶联Sepharose beads的Pull Down实验证实了USP2和COH29之间存在特异性的相互作用,以及通过蛋白质荧光淬灭实验测定了COH29与USP2催化结构域之间的结合解离常数（Kd=6.31±0.25μM）。与此同时,酶催化稳态动力学实验数据表明COH29以可逆和非竞争性模式抑制USP2的去泛素酶活性,相应的酶促动力学Ki值为1.73±0.14μM。后续研究中采用Ub-AMC水解抑制实验测定了COH29对USP亚家族其他成员以及UCHL5的酶活抑制效果,结果显示:COH29不是去泛素化酶的泛抑制剂,然而,由于USP2和USP8的催化结构域具有很高的序列同源性,COH29对USP2和USP8表现出同等强度的抑制活性。在完成分子水平的USP2:COH29结合确认、结合强度测定、作用模式解析以及酶活抑制选择性评估之后,我们开展了细胞水平的由USP2活性抑制介导的COH29抗肿瘤分子机制研究。实验数据表明:COH29能够显著抑制USP2过表达的肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力,而一些关键EMT标志物水平的变化也同时证明COH29可以增强癌细胞的粘附性并抑制EMT进展。前期研究表明,USP2是唯一能够在人类细胞中去泛素化细胞周期蛋白cyclin D1的去泛素化酶。细胞水平的免疫印迹实验结果表明:COH29能够通过泛素-蛋白酶体途径促进细胞内cyclin D1的降解,降低cyclin D1的水平,且COH29对cyclin D1的抑制作用不依赖于GSK3β以及COH29的另一已知靶点RRM2。进一步的研究结果显示:除了cyclin D1外,COH29也能够下调USP2其他底物蛋白Aurora-A、Mdm2和β-catenin的细胞内水平。最后,通过比较COH29在USP2敲低的肿瘤细胞和正常肿瘤细胞中的抗肿瘤活性,研究发现COH29对肿瘤细胞的影响与USP2的表达水平密切相关。综上所述,本论文第一部分研究工作发现了一个新的USP2抑制剂COH29,在分子和细胞水平解析了它的效应机制。在补充阐明COH29的抗肿瘤作用机制同时,本部分研究工作进一步确证了USP2作为抗肿瘤药物研发靶标的可行性,并为高活性、高选择性USP2抑制剂的开发提供了新的骨架结构。论文第二部分研究工作聚焦于由USP2活性抑制介导的天然产物化合物13抗肿瘤分子机制研究。化合物13是一种多酚类天然产物,表现出对USP2较好的抑制活性,Ub-AMC水解抑制实验测定的化合物13对USP2的抑制IC50值为1.14±0.0026μM。除了单泛素化底物之外,化合物13还能够抑制USP2催化水解K48连接的二泛素,并抑制USP2-Ub-PA共价复合物的形成。综合蛋白质热转变稳定性实验、核磁共振实验（CPMG和STD）和荧光淬灭实验的数据结果,确证了化合物13和USP2之间存在特异性的相互作用,二者的结合解离常数Kd值为12.53±0.20μM。后续的酶活抑制选择性实验结果显示:化合物13对USP7、USP8、USP9X和USP28均表现出抑制效果,提示化合物13可能是USP的泛抑制剂。细胞水平的效应机制解析研究结果表明:化合物13能够显著抑制USP2过表达的肿瘤细胞的增殖,并促进USP2底物蛋白cyclin D1的降解。目前少有天然产物作为去泛素化酶抑制剂的报道,化合物13的相关研究成果表明天然产物也是去泛素化酶抑制剂的重要来源之一。然而,由于化合物13可能是去泛素化酶的泛抑制剂,而去泛素化酶在体内的底物蛋白众多,化合物13相关的抗肿瘤作用机制还需要进一步深入阐明。