用于心血管组织再生的新型一氧化氮控释材料的设计制备研究

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作为一种内源性信号分子,一氧化氮(NO)在体内具有多种功能,在心脑血管再生和功能调控,人体免疫应答、神经信号传导和肿瘤抑制等生理过程中都扮演着重要角色。如何实现NO精准递送,是有效实现基于NO生物功能调控和治疗的的重要科学问题。本研究从高稳定性的外源性RSNOs载体设计,外源性NO载体的胞内精准传递,及通过表面催化内源性NO载体实现NO原位释放三个角度,对新型一氧化氮控释材料进行了系统研究:1.针对高稳定性外源性RSNOs载体设计制备难题,本研究首先设计和合成了具有不同侧基结构的聚氨基酸大分子作为外源性NO载体的骨架分子,通过比较不同聚合物合成RSNOs的可行性和产物稳定性,寻找制备高稳定性聚合物基RSNOs类NO载体的规律。研究发现,巯基相连的β-C原子上的甲基所提供的位阻效应能够有效减少或抑制聚合物自聚,而在体系中引入仲胺,不仅能够促进反应的顺利进行,而且还可以通过氢键大大提高生成的RSNOs的稳定性,为设计和制备稳定的聚合物RSNOs载体提供了重要依据。2.针对NO胞内精准传递的生物学要求,本研究将能够通过网络蛋白相关/非相关途径促进药物分子被细胞摄取β-环糊精与具有GSH相应的RSNOs基团相结合,设计合成了新型细胞内传递NO载体。体外释放实验表明,该载体在模拟细胞外环境中十分稳定,而在模拟细胞内GSH浓度(10mmol)下可快速释放;体外细胞实验表明,该载体中的β-环糊精可有效增加细胞对载体的内吞,并利用胞内远高于胞外的GSH浓度,诱导载体在胞内的富集和快速释放,实现NO在细胞内的高效递送。与胞外提前诱导释放的NO相比,这种细胞内传递的NO外源性载体能够更加有效地诱导SMCs产生cGMP,并更有效地抑制SMCs的增殖,并实现内皮细胞对平滑肌细胞的竞争性生长的有效调控,为进一步通过外源性NO实现在血管内皮原位再生提供了可能;3.为有效利用人体血液中存在内源性RSNOs,本研究从GPx还原催化历程入手,利用其与RSNOs降解过程中间产物的相同的基本原理,提出仿酶构建NO催化释放表面的构想。通过将具有高热稳定性的GPx人工酶SeSPI在材料表面修饰制备具有活性的涂层。而在85℃下加热30min后,SeSPI蛋白表面催化释放NO的能力基本不变。而经过完整高压蒸汽灭菌的蛋白表面,依然可以保有可观的NO催化释放能力,释放速率与健康内皮细胞处于同一量级。活性表面催化释放的NO能够促进SMCs分泌cGMP,并抑制SMCs的增殖,同时促进ECs的生长,提高ECs对SMCs的细胞竞争性,有利于诱导快速内皮化的实现。同时,表面催化释放的NO还可以在一定程度上保护ECs,提高其在Ox-LDL刺激下ECs的存活率。而加热后的表面调控细胞行为的能力与未经过加热处理的表面基本一致,表明SeSPI在高温条件下的具有较好的耐受性。这为利用具有GPx功能的人工酶应用于NO释放领域提供了借鉴。
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