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禽传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)引起禽类传染性支气管炎,严重影响禽类养殖业的发展。IBV属于冠状病毒科γ冠状病毒属,为正向单链RNA病毒,基因组大小约为27.6kb。IBV与其它冠状病毒编码的非结构蛋白16(nsp16)具有2’-O-甲基转移酶(2’-O-MTase)活性,与病毒免疫逃逸机制相关。冠状病毒nsp16酶活性中心均由保守的赖氨酸-天冬氨酸-赖氨酸-谷氨酸(KDKE)四个氨基酸残基组成,将其中的D突变为A(丙氨酸)会导致nsp16 2’-O-MTase活性的丧失。本研究旨在利用反向遗传学方法,对IBV nsp16 2’-O-MTase活性中心的D128氨基酸进行突变,使其2’-O-MTase活性丧失,构建并获得含IBV nsp16点突变D128A的重组病毒,通过生物学特性分析和转录组学分析,明确IBV nsp16的生物学功能。结果如下:1、以IBV-P65为遗传背景,利用已建立的IBV反向遗传学方法,分别构建并获得了重组病毒rIBV和含IBV nsp16点突变D128A的重组病毒IBV-D128A。2、以rIBV为对照病毒,通过噬斑试验,病毒生长曲线测定,RT-PCR及Western blot比较分析IBV-D128A的生物学特性。实验结果如下:(1)噬斑试验结果显示感染Vero细胞5d后,IBV-D128A的噬斑平均直径为0.54±0.12 mm,而rIBV的噬斑直径为1.20±0.23 mm,表明突变体病毒D128A的致病力明显降低;(2)两种病毒感染Vero细胞呈现出相似的生长走势,其滴度均在感染24h时达到峰值,但在相同的感染时间点,IBV-D128A的滴度均低于rIBV;(3)半定量RT-PCR检测两种病毒分别感染Vero细胞24h、36h、48h后病毒RNA的合成量,发现rIBV与IBV-D128A的RNA相对表达量比值为1.70、1.43和1.28,表明感染相同的时间,IBV-D128A的核酸表达量低于rIBV;(4)Western blot检测两种病毒感染Vero细胞24 h和36 h后病毒纤突蛋白(spike protein)的表达量,发现感染同样的时间,IBV-D128A的蛋白表达量略低于rIBV。上述结果表明,IBV nsp16的2’-O-MTase酶活性并非为IBV复制所必需,但点突变D128A引起的该酶酶活性的丧失会导致病毒复制降低,致病力明显减弱。3、为了了解IBV感染对宿主基因表达的调控作用,RT-PCR检测rIBV与IBV-D128A分别感染H1299和DF-1细胞相同时间后细胞因子或其它抗病毒基因的表达情况。结果表明两种病毒感染H1299细胞后,细胞内β干扰素IFN-β、白细胞介素6(IL-6)和8(IL-8)的表达未见明显变化。但两种病毒感染DF-1细胞后,发现很多细胞因子或蛋白如IFNγ、IFNα、信号传导子及转录激活子1(Signal transducer and activator of transcription 1,STAT1)、干扰素刺激基因12(Interferon-stimulated gene 12,ISG12)、SOCS3(suppressor of cytokine signaling)、OASL(2′-5′-oligoadenylate synthetase-like)、RSAD2(radical S-adenosylmethionine domain containing 2)、IFITM1(IFN-induced protein with tetratricopeptide repeats 1)都有不同程度的表达,其中,两种病毒感染能上调DF-1细胞IFNγ、STAT1、SOCS3、OASL和RSAD2的表达。结果表明IBV感染DF-1细胞能激活IFNγ信号通路,继而诱导抗病毒相关基因SOCS3、OASL和RSAD2的表达。4、为了明确IBV-D128A致病力降低的机制,揭示2’-O-MTase生物学功能,我们对IBV-D128A和rIBV病毒分别感染DF-1细胞24 h后的RNA样品进行了转录组学分析。结果显示:(1)rIBV和IBV-D128A分别感染DF-1细胞24h后,差异表达的基因(DEG)总共有883个,其中IBV-D128A感染上调的基因有487个,下调的基因有396个;(2)对差异表达基因进行数据库的功能注释,总共得到注释的基因有799个,具体注释到相应功能数据库的类别及个数分别为:COG为292个、GO为725个、KEGG为491个、KOG为531个、NR为777个、Swiss-prot为749个、eggNOG为785个;(3)883个差异表达基因中有725个注释到生物学过程(Biological Process)、分子功能(Molecular Function)和细胞组分(Cellular Component)三大GO分类中;(4)883个差异表达基因中,292个在COG数据库的25类基因功能之中得到注释。其中注释到常规预测(General function prediction only)功能上的差异表达基因为最多,共有104个,占比为25.68%;其次为复制、重组与修复(Replication,recombination and repair)上的差异表达基因为42个,占比为10.37%;与信号转导机制(Signal transduction mechanisms)相关的差异表达基因为32个,占比为7.9%;(5)将883个差异表达基因,注释到与代谢通路KEGG数据库中,发现共有491个DEGs被注释到50个代谢通道上。其中,细胞进程(Cellular Processes)网络中有9条通路共76个DEGs;环境信息处理(Environment Information Processing)网络中有12条通路共106个DEGs;遗传信息处理(Genetic Information Processing)生物网络中有2条通路共11个DEGs;与人类疾病相关的网络有3条通路共43个DEGs;代谢相关的生物过程有14条通路102个DEGs;有机系统(Organismal System)生物网络有9条通路共64个DEG;(6)883个差异表达基因中总共得到151个和免疫有关的18条KEGG信号通道。涉及抗病毒免疫反应中的模式识别受体类、补体系统类、细胞因子类、细胞凋亡类等。通过KEGG模式图分析,发现IBV-D128A感染DF-1细胞后,识别外源dsRNA的TLRs家族中的TLR3和1型干扰素IFNβ明显上调表达,白细胞介素6(IL6)和IL-8上调表达,但IL-18下调表达;(7)关键蛋白的互作分析表明,可由干扰素诱导产生的抗病毒蛋白OASL(2’-5’-oligoadenylate synthetase-like,基因编号为ENSGALG00000013723)是个重要的节点,它可与12种发生互作。这些蛋白的鉴定及其生物学功能正在研究之中。综上所述,我们的研究结果证实了IBV非结构蛋白16的2’-O-甲基转移酶的酶活性并非为IBV复制所必需,但该酶酶活性的丧失会导致IBV复制水平降低,致病力明显减弱;结果也表明,IBV感染DF-1细胞可激活IFNγ信号通路,继而诱导抗病毒相关基因SOCS3、OASL和RSAD2的表达;另外,转录组学分析数据表明IBV-D128A感染DF-1细胞可上调与先天性免疫应答相关的细胞因子及蛋白基因的表达,说明IBV非结构蛋白16与病毒免疫逃逸有关。