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核糖体是细胞内蛋白质合成的场所,它对细胞生长、组织分化和发育都有十分重要的作用。核糖体基因是协同调控的,只有同等比例的rRNA和核糖体蛋白才能够组装起来形成核糖体。真核生物基因的非编码区包括启动子、内含子、5’非翻译区(5’UTR)和3’非翻译区(3’UTR),它们在基因表达过程中起不同程度的作用。本实验室通过生物信息学分析拟南芥核糖体蛋白基因,发现超过95%的拟南芥核糖体蛋白基因启动子-80或-50位点附近存在两个保守基序(Motif1,Motif2),并且类似于人类和酵母的核糖体蛋白基因。几乎所有的拟南芥核糖蛋白基因,其翻译起始位点附近都有一个比较保守的内含子。Rpl36b是核糖体60S大亚基的一个组成部分,它对于核糖体的组装是必不可少的。为研究拟南芥核糖蛋白基因非编码区之间协同表达调控的现象,本实验以编码核糖体蛋白36B(RPL36B)的基因为研究对象。首先用生物信息学方法分析拟南芥全基因组序列,得到无Motif1、Motif2和TATA box的Actin2基因与无Motif1、Motif2且5’UTR长度与RPL36B长度类似的Fructose bisphosphate aldolase(FBA)基因作为构建的材料。然后通过分子生物学方法对RPL36B基因进行了改变,包括用Actin2启动子替换RPL36B启动子、删除RPL36B第一个内含子、拟南芥Actin2启动子替换RPL36B启动子并删除第一个内含子、拟南芥FBA 5’UTR替换RPL36B 5’UTR和移动拟南芥RPL36B第一个内含子。并将包括加有HA标签的野生型RPL36B共六个不同构建,克隆到植物表达载体pCAMBIA1301中。为了精确的研究这些非编码区对拟南芥核糖蛋白基因的调控机制,本实验采用植物表达系统作为研究的系统。采用化学转化法将外源基因转化到农杆菌GV3101,并通过农杆菌侵染法将六个构建转入胡萝卜愈伤组织和烟草悬浮细胞BY2,通过GUS组织化学染色法证明了目的基因已经成功表达。目前已利用Northern、Western方法分别检测mRNA,并分析了外源蛋白的表达情况。为定量分析蛋白表达情况,本实验将删除第一个内含子和替换5’UTR两个构建加上GUS报告基因,并准备做GUS活性分析。下面将进行蔗糖密度梯度,结合Nothern和Western分析六个不同构建在激素存在和不存在条件下基因表达的情况,进而找出哪些非翻译区对基因表达及协同表达调控有重要意义。