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乳酸菌因其优良的性能被广泛应用于众多领域,但在发酵过程中菌株因遭受酸胁迫,导致细胞生长和代谢活性的显著下降,抑制菌株发挥益生功能。因此,提高乳酸菌的酸胁迫耐受性尤为迫切。作为酸胁迫的首要靶点,细胞膜以多种方式抵御酸胁迫对细胞的损伤,但目前应用膜蛋白提高乳酸菌酸胁迫抗性的研究还鲜有报道。本论文在Lactococcus lactis NZ9000中过量表达多种膜蛋白基因,利用转录组学与分子生物学手段,确定了部分与酸胁迫抗性相关的抗酸元器件。通过在L.lactis NZ9000中过量表达酸胁迫条件下表达水平显著上调的膜蛋白基因,筛选获得耐酸重组菌株L.lactis(ZitP)和L.lactis(ZitQ),其存活率分别是对照菌株L.lactis(pNZ8148)的14.5和9.5倍(pH 4.0乳酸胁迫4 h);酸胁迫条件下,重组菌株胞内pH维持相对平衡,且胞内ATP含量均高于对照菌株,pH 4.0胁迫3 h后,L.lactis(ZitP)和L.lactis(ZitQ)胞内ATP含量分别为对照菌株的7.7和11.7倍。为揭示ZitP(金属离子ABC转运蛋白通透酶)和ZitQ(金属离子ABC转运ATP结合蛋白)膜蛋白帮助细胞抵御酸胁迫的作用情况,本研究利用比较转录组学的方法分析了重组菌株和对照菌株在正常条件和酸胁迫条件下的差异基因表达。结果表明,编码ABC转运家族蛋白(ecfA2和azlC)和金属离子转运蛋白(mtsC和zitS)的基因显著上调;一些转录调控因子(MarR家族转录调控因子、spxA基因)和应激蛋白(cspABD2)发生显著上调,推测这些基因的差异表达有助于保护细胞免受致死环境的损害。基于转录组学分析发现,在L.lactis(ZitP)和L.lactis(ZitQ)中显著上调的膜蛋白基因分别有7和6个,共有的差异表达上调的基因有10个。结合分子生物学操作,从上述显著上调的基因中验证并获得抗酸元器件secG(前蛋白转位酶亚基)、ecfA2(能量偶联因子转运蛋白ATP酶)和purC(磷酸核糖氨基咪唑-琥珀酰胺合酶),其过量表达重组菌株的存活率分别是对照菌株L.lactis(pNZ8148)的20.9、598.7和83.2倍(pH 4.0乳酸胁迫4h)。进一步研究发现,重组菌株L.lactis(SecG)和L.lactis(EcfA2)胞内ATP含量明显高于对照菌株,胁迫条件下,胞内ATP含量分别为对照菌株的6.5和4.8倍,为细胞抵御酸胁迫提供能量;而L.lactis(PurC)在酸胁迫条件下能够产生较多的胞内天冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸和γ-氨基丁酸,促进细胞抵御酸胁迫。膜蛋白ZitP和ZitQ与抗酸元器件共表达的效果分析表明,共表达重组菌株L.lactis(ZitP/SecG)、L.lactis(ZitQ/EcfA2)、L.lactis(ZitP/PurC)和L.lactis(ZitQ/PurC)的存活率分别是对照菌株L.lactis(pNZ8148Dual)的3.7、54.9、174.3和102.8倍(pH 4.0乳酸胁迫4 h),证实了上述抗酸元器件组合表达对提升菌株酸胁迫抗性的作用效果。本论文探究了膜蛋白ZitP和ZitQ提高乳酸菌酸耐受性的作用情况,并通过转录组学与分子生物学技术的结合,挖掘并证实了secG、ecfA2和purC元器件的抗酸作用效果,为构建耐酸工业菌株提供了新的思路。