目的:大肠埃希菌(Escherichia coli,E.coli)是临床上最常见的机会致病菌,感染部位广泛,某些菌株具有毒力因子,能直接引起肠道感染。当机体免疫力低下,细菌可侵入肠外组织或器官而引起肠外感染。铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是造成医院内感染的重要条件致病菌,在临床上可引起许多病症。近年来,抗生素的广泛使用及不合理应用使得耐药菌株不断增多,细菌的耐药问题越来越严重,特别是多重耐药的大肠埃希菌和铜绿假单胞菌的临床检测分离率也逐年升高,给其感染性疾病的预防和治疗带来了极大困难。细菌噬菌体(bacteriophage,phage)简称噬菌体,是一类能特异性感染细菌的病毒,其中毒性噬菌体具有裂解杀灭细菌的能力。随着细菌耐药问题的日益严峻,人们开始重新考虑采用毒性噬菌体来杀灭耐药菌,噬菌体的研究及应用逐步受到越来越多的关注,近几年大量新的噬菌体被分离鉴定并深入研究。本课题分离鉴定了新的大肠埃希菌B2和铜绿假单胞菌噬菌体YP3,它们都是毒性噬菌体,理化性质稳定,基因组及病毒颗粒的质谱分析表明其基因组不编码功能已知的毒性基因。同时大肠埃希菌B2和铜绿假单胞菌噬菌体YP3能有效感染裂解临床随机分离的耐药菌株,具有进一步应用于临床抗感染的可能。通过进一步研究其与宿主菌的相互作用及动物感染模型治疗实验,为噬菌体B2和YP3真正用于对抗耐药性大肠埃希菌及铜绿假单胞菌的感染提供理论基础。方法:1、运用模式菌株MG1655、PAO1、PA14以及医院病人分离所得大肠埃希菌及铜绿假单胞菌菌株作为宿主,从南京市污水源中分离筛选出具有良好裂解细菌能力的大肠杆菌及铜绿假单胞菌噬菌体,分别将其命名为:B2、YP3。2、通过不断挑取噬菌斑侵染宿主菌悬浮液,初步纯化噬菌体,并观察其噬菌斑形态、生长规律及测定宿主范围。3、运用随机克隆鉴定测序噬菌体部分基因组。4、超高速氯化铯密度梯度离心纯化噬菌体B2、YP3,电镜观察形态、大小、记录其生长曲线、温度稳定性及杀菌效果。5、进行噬菌体病毒颗粒结构进行蛋白电泳检测,并进一步进行蛋白质谱分析。6、对噬菌体全基因组测序及分析。7、建立铜绿假单胞菌小鼠肺部感染模型,检测噬菌体YP3对感染小鼠的治疗效果。结果:以模式菌MG1655和临床病人分离所得铜绿假单孢菌菌株P2321作为宿主,分离筛选得到新的噬菌体,将其分别命名为:B2、YP3。首先对噬菌体的生物学特性进行研究:B2是可以特异性的裂解大肠埃希菌、YP3可特异性裂解铜绿假单胞菌的毒性噬菌体,两者都形成清晰透亮的噬菌斑;透射电子显微镜观察发现,分属长尾病毒科Siphoviridae家族和肌尾病毒科Myoviridae家族。噬菌体B2和YP3在较宽泛的温度范围下都能保持活性稳定,表明其具有良好的温度稳定性,易于保存和运输;一步生长曲线表明噬菌体B2的潜伏期短、爆发量大、复制能力强;噬菌体YP3潜伏期短,在短时间内可杀灭细菌。其次进行噬菌体宿主谱及杀菌效果的检测:B2可裂解7株临床随机分离的多耐药大肠杆菌菌株(裂解率:19%),YP3可裂解15株临床随机分离得到的多耐药的铜绿假单胞菌菌株(裂解率:75%);细菌挑战实验证实B2、YP3可有效抑制其相应宿主细菌生长,并能在短时间内杀灭细菌。因此,噬菌体B2、YP3成为可用于相应病原菌的生物防治以及治疗临床多耐药菌感染的良好候选者。此外我们检测并分析了噬菌体B2和YP3的基因组及病毒颗粒的结构蛋白。噬菌体B2的基因组全长为44283 bp,由环状双链DNA组成,GC含量为54.77%,有65个开放阅读框(ORF)。将25种预测功能蛋白分为五个功能组:DNA复制或修饰、宿主裂解、组装、结构蛋白以及额外的功能。噬菌体B2是一种裂解性噬菌体,且基因组分析表明B2不编码与毒素或其他毒力因子相关的基因,具有应用于噬菌体治疗的潜在可能。质谱鉴定出B2的21种蛋白质,其中13种已知结构蛋白中的12种结构蛋白被鉴定到,同时还鉴定了一些假定蛋白。通过B2及其相关同源噬菌体基因组的进化研究分析表明:水平交换和垂直基因顺序重排可能同时参与此类噬菌体基因组的进化,进而参与噬菌体适应宿主菌的进化过程。噬菌体YP3的基因组全长为92709 bp,由线状双链DNA组成,GC含量为49.4%,有190个开放阅读框(ORF),质谱鉴定出63种蛋白质,包括已知结构蛋白和假定蛋白。研究发现YP3的基因组编码许多假定蛋白,可能包含具有抗菌活性的酶,同时噬菌体基因组全序列分析也有利于进一步研究噬菌体与宿主之间的相互作用,为噬菌体真正应用于对抗多耐药的铜绿假单胞菌感染打下基础。最后,在临床分离多耐药铜绿假单胞菌菌株肺部感染的小鼠模型中,发现加入噬菌体YP3后明显提高感染小鼠的存活率,证明YP3在体内能抑制铜绿假单胞导致的感染,为噬菌体治疗提供参考依据。