【摘 要】
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腺疫作为急性接触性疾病,主要由马链球菌马亚种（Streptococcus equi subsp.equi,S.equi）所引起,在马属动物中具有较高的发病率,可对马属动物养殖业造成巨大的经济损失。S.equi可感染所有年龄阶段的马属动物。现今对S.equi的致病机理、毒力因子的研究及感染过程中的宿主相互作用及致病机制的研究尚不透彻。本研究对新疆地区驴源马链球菌马亚种的基因组进行了测序及比较分析,期
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（项目编号:U1803108）；
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腺疫作为急性接触性疾病,主要由马链球菌马亚种（Streptococcus equi subsp.equi,S.equi）所引起,在马属动物中具有较高的发病率,可对马属动物养殖业造成巨大的经济损失。S.equi可感染所有年龄阶段的马属动物。现今对S.equi的致病机理、毒力因子的研究及感染过程中的宿主相互作用及致病机制的研究尚不透彻。本研究对新疆地区驴源马链球菌马亚种的基因组进行了测序及比较分析,期望能为腺疫的防治、疫苗的开发、治疗药物的设计提供广泛的基因组学信息。本研究通过对分离鉴定的3株驴源S.equi新疆分离株:HT1112、HTP133和HTP232的生长特性、耐药特性及毒力进行分析。其中HT1112最快进入对数期,其次是HTP133和HTP232。通过小鼠模型评价菌株毒力大小,结果显示HTP133菌株对小鼠的毒力作用最强,其次为HTP232和HT1112。攻毒后的小鼠肺脏荷菌量高于脾脏的荷菌量,且HTP133攻毒组的菌体载量最高。HT1112对头孢西丁、青霉素、克拉霉素、环丙沙星、磺胺嘧啶和克林霉素耐药,HTP133和HTP232对头孢呋辛和青霉素耐药。提取HT1112、HTP133和HTP232菌株的基因,利用IIumina和Pac Bio RS II测序平台对各菌株进行全基因组测序。得出（1）HT1112菌株基因大小为2.16 Mb,GC含量为41.36%,可编码2 167个基因,通过VFDB和CARD数据库比对,预测出112个毒力基因和134个耐药基因;（2）HTP133菌株基因大小为2.15 Mb,GC含量为41.34%,可编码2 010个基因,通过VFDB和CARD数据库比对,预测出169个毒力基因和124个耐药基因;（3）HTP232菌株基因大小为2.19 Mb,GC含量为41.3%,可编码2 223个基因,通过VFDB和CARD数据库比对,预测出170个毒力基因和172个耐药基因;（4）基于16S r RNA系统进化分析和看家基因进化分析,HT1112菌株与S.equi 4047的同源性最近。3株驴源S.equi与国际菌株进行基因组共线性比较,结果表明各菌株之间存在重排和倒位现象。3株驴源菌株HT1112、HTP133和HTP232共线性较好,且HTP232菌株在共线性比较具有独有的一段表达透明质酸酶（hyaluroniase,HAase）的基因。同时,基于看家基因与核心基因进行基因进化分析,显示本研究中的3株驴源S.equi的同源性较近。对4种毒力因子Se M、Ide E、Ide E2和EAG进行同源性比较,比较菌株的Ide E、Ide E2和EAG的同源性为99.9%-100%,Se M的同源性为97%-99.6%,并且此结果与基因组共线性比较的结果具有一致性。表达纯化SeM、IdeE、IdeE2和EAG蛋白并且分别免疫小鼠。ELISA检测免疫后血清中的细胞因子含量,结果显示Se M和EAG免疫组的IFN-γ、IL-4、IL-6和IL-10表达量显著高于Ide E和Ide E2组（P＜0.05）。使用XJ 5012菌株对各免疫组小鼠进行攻攻毒,结果显示Ide E2免疫组的保护率最高,为80%,EAG和Se M免疫组的保护率为66.7%,Ide E免疫组的保护率为50%。各免疫组的小鼠脏器荷菌量结果显示Ide E2免疫组的脏器荷菌量最低,Se M和Ide E免疫组的次之,EAG免疫组最高。通过q PCR检测免疫攻毒后小鼠脾脏的细胞因子表达水平,结果显示Ide E免疫组IFN-γ、TCR、MHC I、RP105、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR6和TLR9表达水平显著高于其他免疫组（P＜0.05）;Ide E2免疫组IL-10的表达水平显著高于其他免疫组（P＜0.05）;EAG免疫组MHC II、IL-2、IL-4、IL-6、IL-12和IL-17A的表达水平显著高于其他免疫组（P＜0.05）。综上所述,本研究对3株驴源S.equi新疆分离株进行了生物学特性、毒力大小及耐药性的比较与分析,并对分离菌进行全基因组测序及共线性比较,对3株菌的毒力相关因子进行了序列及生物学功能的分析,为从基因组水平认识该菌的致病机制及防控提供了理论基础。
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