前言间质性肺疾病(ILD)是由200余种疾病组成的一类疾病，他们在临床表现、实验室和病理学改变上具有一定的共同特点，但又有各自不同的特征。肺纤维化的典型病理学过程为肺泡上皮损伤，炎性细胞聚集，成纤维细胞过度增殖，细胞外基质沉积，成纤维细胞增殖灶，以及蜂窝肺的形成。博莱霉素可导致啮齿类动物急性肺损伤和肺纤维化，这一特点为研究肺间质纤维化提供了成熟的动物模型。最近研究表明，氧化/抗氧化失衡(即氧化应激)可诱导转录因子核因子-κB(NF-κB)的活化，具体机制尚不清楚。NF-κB是重要的转录因子，调节许多炎症性细胞因子的转录，P65是其重要的功能亚单位。我们先前的研究显示，在BLM诱导的肺间质纤维化病理过程中，NF-κB的表达明显增强。本研究旨在探讨NF-κB的活化与氧化/抗氧化失衡的关系及其在肺间质纤维化发病机制中的作用，并进一步研究抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)治疗肺间质纤维化的作用机制。材料与方法一、实验材料1、实验动物8周龄雌性C57BL/6小鼠体重，17-20g，无特殊病原体SPF级(北京维通利华实验动物技术公司)。2、实验药品10％水合氯醛，博莱霉素(天津太河制药有限公司)，N-乙酰半胱氨酸(海南赞邦制药有限公司)。3、实验试剂NF-κBP65免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；P65 m-RNA原位杂交试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；IL-4与TGF-β1酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(上海森雄科技实业有限公司)；羟脯氨酸(HYP)、谷胱甘肽(GSH)与丙二醛(MDA)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。4、实验设备紫外光、可见光连续分光光度计(法国S500-P)；全自动酶标仪(奥地利TECAN)；超声匀浆机(德国UPH-200)。二、实验动物模型的建立、分组与标本处理1、动物模型的建立、分组80只雌性小鼠随机分为3组，所有实验小鼠均用10％水合氯醛(3ml／kg)腹腔注射麻醉后，无菌手术暴露气管。①模型组：35只，第0天向气管内注入20μl含100μg博莱霉素(BLM5mg／kg)的无菌生理盐水。②治疗组：35只，在气管内注入博莱霉素前5天，开始每天将含NAC5mg的0.25ml的溶液灌入每只小鼠(NAC250mg／kg)胃内直至处死取材，每日一次。②对照组：10只，第0天气管内注入生理盐水20μl，7天后处死取材。2、取材与标本的处理在实验的第1、3、7、14、28天对模型组和治疗组取材，以腹腔主动脉放血法处死实验小鼠。(1)支气管肺泡灌洗方法麻醉成功后，仰卧位固定小鼠，暴露气管，将20号套管针插入气管，经此插管用室温生理盐水1ml反复灌洗3次即可回收70％以上的支气管肺泡灌洗液(BALF)，将其3000r／min离心10min分离细胞与上清，上清液与左肺组织-70℃保存待测，所得沉淀细胞进行离心涂片，行免疫组化及原位杂交染色检测p65蛋白及其m-RNA的表达。(2)肺组织标本的处理小鼠放血法处死后，开胸，结扎左支气管，经气管向右肺灌注固定液(4％多聚甲醛)直至肺膨胀表面平滑，结扎气管后取出该肺，放入4％多聚甲醛中固定3h，常规石蜡包埋，制成肺组织蜡块。三、肺组织常规病理分析1、常规病理肺组织经不同浓度酒精常规脱水，制成5μm的肺组织石蜡切片，行HE染色与Masson染色。2、肺泡炎症及纤维化程度的组织病理学评分方法依照Szapiel法确定肺泡炎症及纤维化的程度，两者均分4级，分别记为1、2、3、4分。四、检测指标及方法1、样本用碱水解法测定肺组织羟脯氨酸HYP含量。2、比色法测定肺组织及BALF中MDA、GSH及蛋白含量。3、酶联免疫吸附法(ELISA)法测定BALF中IL-4与TGF-β1含量。4、免疫组化染色与原位杂交染色法分别测定支气管肺泡灌洗细胞P65蛋白及其m-RNA的表达。5、观测小鼠的体重变化。五、统计学处理应用SPSS13.0统计软件进行分析，所有数据均以(?)±s表示，计量资料采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。结果一、三组小鼠肺组织病理结果肺组织病理HE染色显示，模型组小鼠经气管注射博来霉素后7天，肺泡间隔增厚，肺泡腔内可见渗出改变，内有炎症细胞浸润；14天时肺间质大量炎症细胞浸润，肺泡间隔明显增厚，可见多发片状实变，Masson三色染色可见肺间质内有明显的胶原沉积；第28天肺组织可见大片的实变，其间可见大量的炎症细胞浸润，肺泡结构明显丧失，Masson三色染色可见肺间质大量的胶原沉积，正常的肺泡结构明显丧失，形成明显的纤维化改变。与模型组小鼠相比，NAC治疗组小鼠第7天肺泡炎明显减轻，肺泡间隔略有增厚，炎症细胞浸润较模型组明显减轻；第28天可见肺实变程度较模型组明显减轻，可见破坏的肺泡结构，肺泡间隔增厚明显，间质内可见大量炎症细胞浸润，有明显胶原沉积。二、三组小鼠肺泡炎症及纤维化程度的病理学评分结果1、三组小鼠肺泡炎症程度病理评分比较气管注射博来霉素后7天与14天，BLM组小鼠肺泡炎症评分为3.5±0.6与3.0±0.5，治疗组小鼠肺泡炎症评分为2.5±0.3与2.1±0.2，两组间进行比较的结果显示，NAC明显减轻了BLM诱导的肺泡炎症程度(P＜0.01)2、三组小鼠肺组织纤维化程度病理评分比较气管注射博来霉素后，随着实验时间的延长，BLM组与治疗组小鼠肺组织纤维化程度逐渐加重。在注射博来霉素后28天，BLM组小鼠肺组织纤维化评分结果为3.8±0.5，肺纤维化程度最明显，与治疗组(2.2±0.6)比较的结果显示，NAC明显减轻了BLM诱导的肺组织纤维化程度(P＜0.01)。三、HYP含量的比较模型组小鼠第28天时的肺组织HYP含量为(696.5±41.2μg／g)，与对照组(348.0±22.6μg／g)比较，增长了大约两倍，两者间有显著的统计学差异(P＜0.01)。在注射博莱霉素后第7、14、28天，治疗组HYP含量分别为450.6±27.1μg／g、520.3±22.8μg／g和575.6±23.4μg／g，虽分别较对照组明显增加(P值分别为0.045，0.03和0.015)，但与相应时间的模型组(分别为495.4±23.6μg／g，595.4±37.8μg／g和696.5±41.2μg／g)比较，HYP含量分别显著降低(P值分别为0.046，0.03和0.02)。这说明NAC明显减轻了BLM诱导的肺间质纤维化程度。四、MDA、GSH的含量1、肺组织中GSH与MDA的含量(1)肺组织中GSH含量气管注射BLM后7天，模型组小鼠肺组织GSH水平(86.2±10mg／gprot)与对照组(130.3±12mg／gprot)比较，明显降低(P＜0.01)，而治疗组小鼠肺组织GSH水平为135.2±15mg／gprot明显高于模型组，两组间有显著的统计学差异(P＜0.05)；28天时模型组小鼠肺组织GSH含量仍低于正常对照组，但两者间无显著性差异。(2)肺组织中MDA含量气管注射BLM后，模型组小鼠肺组织MDA水平逐渐升高，7天时达峰值，为2.73±0.41nmol／mgprot，与对照组(1.1±0.2nmol／mgprot)比较有显著的统计学差异(P＜0.01)；而7天时治疗组小鼠肺组织MDA含量为1.91±0.36nmol／mgprot，较模型组下降，两者间有显著的统计学差异(P＜0.05)；14天和28天时两组MDA水平均逐渐下降并接近正常。2、BALF中MDA与GSH的含量(1)BALF上清中GSH含量气管注射BLM后7天时，模型组小鼠BALF中GSH水平为343.0±31.6mg／L，较对照组(441.6±43mg／L)明显降低(P＜0.05)；而治疗组BALF中GSH含量为518.8±48.7mg／L，与模型组及对照组相比，GSH水平分别有明显的增高(P值均小于0.01)。(2)BALF上清中MDA含量气管注射BLM后7天时，模型组小鼠BALF中MDA水平为3.27±0.36nmol／ml，较对照组(1.55±0.23 nmol／ml)明显升高(P＜0.01)；而治疗组BALF中MDA含量为2.82±0.14 nmol／ml，较模型组明显下降(P＜0.05)(表4)。五、支气管肺泡灌洗细胞P65免疫组化染色与P65 m-RNA原位杂交染色结果1、支气管肺泡灌洗细胞P65免疫组化染色结果在气管注射博莱霉素后第7、14天，模型组和治疗组的支气管肺泡灌洗细胞P65的表达分别为(43.4±2.6)％，(21.2±1.7)％和(21.4±2.3)％，(12.7±0.7)％，较对照组(6.6±1.1)％，(7.0±1.0)％明显增高(P＜0.05)，治疗组与模型组相比，对应时间点P65的表达分别明显降低(t值分别为10.23和6.24，P值均小于0.05)2、支气管肺泡灌洗细胞P65 m-RNA原位杂交染色结果气管注射博莱霉素后第7、14天，模型组和治疗组的支气管肺泡灌洗细胞P65m-RNA的表达分别为(42.2±1.4)％，(26.4±2.4)％和(25.2±3.2)％，(17.1±4.4)％，较对照组(7.0±1.3)％，(7.2±1.2)％明显增高(P＜0.05)，治疗组与模型组相比，对应时间点P65m-RNA的表达分别明显降低(t值分别为9.69和7.65，P值均小于0.05)六、MDA、GSH与P65的相关分析气管内注射BLM后7天，P65与MDA的相关分析：BLM组BALF细胞表达的P65与MDA呈正相关(r=0.738，P＜0.05)，而与GSH呈负相关(r=-0.450，P＜0.05)。另外，BALF细胞表达的P65m-RNA与MDA也呈正相关(r=0.648，P＜0.05)。七、BALF中IL-4与TGF-β1的含量1、IL-4含量的比较模型组和治疗组小鼠气管注射BLM后，BALF中IL-4含量升高，1天和7天时升高明显，分别为56.8±11.0 pg／ml、47.8±11.9 pg／ml和47.4±11.3 pg／ml、41.9±10.7 pg／ml，较对照组(31.1±8.5 pg／ml)明显增高(t值分别为4.763、4.012和4.038、3.439，P值分别为0.01、0.02和0.02、0.03)。治疗组与模型组相比，对应时间点IL-4的表达分别明显降低(t值分别为3.682和3.517，P值为0.02和0.03)，这说明NAC可明显抑制BLM诱导的小鼠BALF IL-4的升高。2、TGF-β1含量的比较模型组和治疗组小鼠气管注射BLM后，BALF中TGF-β1含量升高，7天和28天时升高明显，分别为460.4±29.6pg／ml、381.4±97.6pg／ml和321.0±63.5pg／ml、324.2±71.7pg／ml，较对照(239.4±29.6pg／ml)明显增高(t值分别为17.216、10.903和6.416、5.114，P值分别为0.001、0.002和0.007、0.007)，治疗组和模型组相比，对应时间点TGF-β1的表达分别明显降低(t值分别为8.539和4.434，P值为0.001和O.021)，这说明NAC可明显抑制BLM诱导的小鼠BALF TGF-β1的升高。八、三组小鼠的体重变化模型组与治疗组小鼠的体重从气管注射博莱霉素后第3天开始明显下降，7天时下降最明显，以后体重逐渐增加，而对照组小鼠体重在实验期间一直增加。在气管注射博莱霉素第7、14、28天，模型组小鼠体重分别为15.7±0.29g、17.5±0.5g和20.2±0.29g，治疗组小鼠体重分别为17.5±0.5g、19.7±0.29g和22.5±0.5g，对照组小鼠体重分别为20±0.5g、22±0.5g和23.5±0.5g，模型组和治疗组体重均低于对照组(P值均小于0.05)，而模型组与治疗组相比，对应时间点体重明显降低(t值分别为-5.5、-6.5和-7；P值分别为0.01、0.007和0.006)，这说明NAC抑制了BLM造成的小鼠体重降低。结论1、氧化／抗氧化失衡参与了博莱霉素诱导的急性肺损伤和肺纤维化过程，并在病理过程中具有重要作用。2、氧化／抗氧化失衡可能通过激活NF-κB，从而调节IL-4、TGF-β1等细胞因子释放，进而导致肺间质纤维化的形成。3、NAC在一定程度上可减轻博莱霉素所致的急性肺损伤和肺纤维化程度，其机制可能与NAC抑制NF-κB的活化，减少纤维化相关的细胞因子产生有关。