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目的:早发性卵巢功能不全（Premature ovarian insufficiency,POI）的发病率逐渐升高,且发病年龄逐渐年轻化,严重影响育龄女性的生育能力及生活质量。POI的发病机制尚不十分明确,临床治疗有两个方向,其一从病因上探索,其二是对其后果的补充治疗;这些均处于探索阶段,亟待研发更有效的治疗药物。长期的临床实践发现一些中药典方对该病有明显的疗效。基于上述原因,本研究选取临床上治疗POI常用的中药方剂和单味药,运用网络药理学方法,预测其治疗POI的通路和靶点。并通过构建POI小鼠模型和靶点基因沉默稳转株颗粒细胞模型,从体内、体外两个层面验证预测获得靶点的表达变化与疾病表型的关系及可能机理,为拓宽中药典方的临床应用和研发治疗POI的新药奠定基础。方法:1.网络药理学:从TCMSP中筛选金匮肾气丸及高频单味药的活性成分,从SwissTargetPrediction、SAE、PharmMapper数据库对筛选出的活性成分进行靶标预测,在Drugbank、GeneCards、OMIM数据库中筛选POI的疾病相关靶点,通过对比分析后,获得中药处方治疗POI的潜在靶点,在STRING数据库中查询靶点间的信息,Cytoscape构建网络并分析,对潜在靶点进行KEGG和GO富集分析,筛选出核心的生物学过程和信号通路。应用Autodock软件,实现金匮肾气丸的核心靶点和核心组分的分子对接验证。2.体内实验:选取有连续两次规律动情周期的8周龄ICR小鼠,每天灌胃雷公藤多苷混悬液50 mg/（kg·d）,连续15天,对照组小鼠注射同等剂量生理盐水。HE染色法行卵巢病理组织学分析,酶联免疫吸附实验检测各组小鼠模型血清激素水平;免疫组化法检测卵巢组织中颗粒细胞凋亡相关蛋白Bax、BCL-2、Caspase3的表达,蛋白质印迹法检测PPARG、ESR1、ESR2、CYP17A1、CYP19A1、AR的蛋白表达。3.体外实验:培养人卵巢颗粒细胞系KGN,构建PPARG干扰稳转株,根据目标基因设计合成shRNA干扰序列,退火,将其与双酶切的RNA干扰载体pMAGic 1.1进行重组,构建慢病毒质粒。筛选阳性克隆和测序鉴定后,进行病毒包装、纯化并感染KGN细胞,嘌呤霉素筛选稳定敲减侵染株,通过Westren blot和qRT-PCR检测PPARG的mRNA和蛋白水平的敲减效果,得到稳转株后,Elisa法检测细胞上清水平,Westren blot 检测 CYP19A1、ESR1、ESR2 的蛋白表达。结果:1.网络药理学预测分析:检索出POI相关靶点173个,金匮肾气丸活性成分102个,白芍活性成分13个,杜仲活性成分25个,黄精活性成分12个,熟地黄活性成分2个。预测出金匮肾气丸潜在靶点432个,整理取交集后得到金匮肾气丸治疗POI的潜在靶点81个;预测白芍活性成分潜在靶点372个,杜仲潜在靶点556个,黄精潜在靶点407个,熟地黄潜在靶点101个。生物信息学研究结果显示,HIF-1 signaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway、Estrogen signaling pathway 是药物作用的主要响应通路,其中的关键蛋白质为PPARG、ESR1、ESR2、CYP17A1、CYP19A1、AR是潜在的核心靶点。2.核心靶点的体内实验验证:与对照组小鼠相比,POI模型组小鼠易被激惹,卵巢指数下降,动情周期延长,卵巢组织病理学结果显示模型组小鼠闭锁卵泡增多（P＜0.001）,原始卵泡减少但无统计学差异,初级及次级卵泡减少（P＜0.05或P＜0.01）,卵巢间质纤维化。模型组小鼠血清中E2、AMH水平下降（P＜0.01,P＜0.001）,FSH、LH水平升高（P＜0.05）。BAX、Caspase-3在模型组小鼠卵巢组织中的表达均高于对照组（P＜0.01,P＜0.05）,Bcl-2表达明显降低（P＜0.05）,Bax/Bcl-2比值增大。POI模型组小鼠卵巢组织中CYP19A1、ESR1、ESR2、CYP17A1的表达水平显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。PPARG、AR的表达水平显著增加（P＜0.05或P＜0.01）。综合分析后以靶点PPARG为核心进行体外实验验证。3.核心靶点的体外实验验证:结果显示PLVE3677靶点的基因沉默效果较好,选用该稳转株细胞进行后续实验。通过对PPARG基因表达进行干扰调低后,结果显示,与对照组相比,KGN-PLVE3677组细胞E2升高（P＜0.01）,AMH、FSH升高,LH降低,但无统计学意义。CYP19A1、ESR1、ESR2的蛋白表达水平均上升（P＜0.05 或P＜0.01）。结论:1.网络药理学预测金匮肾气丸中的薯蓣皂苷元、泽泻醇B、羟基芫花素、去氧穿心莲内酯、胡椒碱、槲皮素等核心化合物可能作用于ESR1、VEGFA、AKT1等分子,通过PI3K-Akt、MAPK、HIF-1等信号通路介导细胞增殖和分化、衰老与凋亡,通过抗炎、抗氧化、调节激素合成与分泌等机制发挥对POI的治疗作用。2.网络药理学预测POI的治疗通路为HIF-1 signaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway、Estrogen signaling pathway,核心靶点为 PPARG、ESR1、ESR2、CYP17A1、CYP19A1、AR。3.体内和体外实验验证发现PPARG可通过调节ESR1、ESR2、CYP19A1的表达上调雌激素水平,改善POI的症状,可望作为POI的治疗靶标。