λ噬菌体Red重组酶介导高效率的体内同源重组,在转基因动物载体改造、细菌遗传特性改造等多方面发挥重要作用,为了研究exo、beta和gam基因表达与重组效率之间的关系,首先将exo、beta和gam基因分别构建在原核表达载体pEGKG和pET28a上,转化大肠杆菌BL21(DE3)和DH5α,经IPTG诱导后,在大肠杆菌中获得可溶性表达重组酶蛋白His-Exo、GST-Exo、His-Beta、GST-Beta、His-Gam、GST-Gam。接下来先利用阴离子交换柱对Exo蛋白进行初步纯化,纯化后的His-Exo蛋白再利用Ni-NTA介质填充的层析柱分离纯化蛋白,GST-Exo蛋白利用谷胱甘肽Sepharose 4B介质填充的GSTrap FF层析柱分离纯化蛋白。经二次纯化后的蛋白利用NC膜结合法制备抗原蛋白并免疫试验动物。ELISA结果显示血清抗体效价可达到l∶12800。通过Western免疫印迹自制的多克隆抗体能特异地与Exo重组蛋白相互作用。该蛋白纯化方法操作简单,制备的抗原纯度高,制备的多克隆抗体特异性好。前列腺癌(Prostate Cancer, PCa)是男性生殖系统肿瘤中非常重要的一种,在美国前列腺癌发病率在所有恶性肿瘤中居第一位,死亡率仅次于肺癌。前列腺癌发病隐匿且病程漫长,给临床研究带来一定的困难,因而建立代表前列腺癌临床过程的生物学研究模型具有重要意义。目前国外已有几种前列腺癌转基因小鼠模型,国内相关的研究报道则很少。Cre重组酶由Sternberg等于1981年从P1噬菌体中发现,编码38 kDa蛋白质,属于λ整合酶超基因家族,是一种位点特异性重组酶,能介导34 bp的Loxp位点之间的高精确的特异重组,不需要其他辅助因素。Cre/LoxP能在小鼠体内进行有效的基因删除、插入、易位和倒位。为了便于通过Cre/LoxP系统制备前列腺组织特异性条件基因打靶的前列腺癌小鼠模型,本研究中我们利用前列腺组织特异性表达的PSP94基因的启动子驱动Cre重组酶基因表达,创建PSP94-Cre转基因小鼠。通过显微注射的方法将8 kb含PSP94-Cre的转基因片段引入小鼠受精卵,获得子代小鼠20只,经基因型鉴定有5只小鼠在基因组上整合有PSP94-Cre基因,整合率为25%。前列腺癌是雄激素依赖性的肿瘤,雄激素的生物学效应是由雄激素受体(androgen receptor,AR)介导的。AR主要通过调节靶基因的转录发挥促进或抑制前列腺癌生长的生物学效应。大量研究发现,AR在前列腺癌的发展过程中可能起双向作用,AR既能促进前列腺癌细胞生长,也能促进前列腺癌细胞凋亡。AR基因表达在前列腺癌内分泌治疗抵抗的发生中的作用是目前研究的热点。PC3前列腺癌细胞是雄激素非依赖、前列腺癌转移细胞,PC3不表达AR蛋白。我们应用基因转染技术将携带AR的质粒pCMV-Tag 2B-AR稳定转染到PC3细胞,建立起稳定表达AR的细胞株PC3-AR,然后检测PC3-AR增殖情况,旨在探讨AR对雄激素非依赖细胞增殖能力的影响。前期研究表明PC-1基因表达促进前列腺癌细胞增殖,PC-1和AR能发生蛋白质分子间的相互作用。为了研究PC-1对AR转录激活活性的影响,我们用LNCaP/C4-2和PC3(AR)前列腺癌细胞模型,将PC-1的一系列不同结构域的缺失突变体与PSA-LUC共转染到上述细胞,发现PC-1 N端46个氨基酸的表达能降低AR的转录活性,在R1881的诱导下PC-1能在细胞核内表达,并在细胞核与AR共定位。