牙鲆(Paralichthys olivaceus)是一个优良的高效海水养殖品种。目前在国内被广泛养殖,给养殖业创造了良好的经济效益。但是目前的主要养殖方式是室内工厂化,与海上的网箱养殖相比,养殖密度大,水质容易恶化,称为各种疾病的诱因,而且牙鲆具有水底集群的习性,使得疾病传染加剧,虽然利用一些药物取得了一定的防治效果,但是长期的施药不仅会导致水体的污染,也会造成诸多耐药性病原体的产生,为进一步的防治工作变得更为复杂。因此进行牙鲆相关的鱼类免疫学研究是必要和必须的。本文的研究内容和结果主要包括以下几个方面: 首先,探索了SMRV 病毒和鱼类培养细胞的相互作用,结果发现,SMRV 病毒感染的CLC 细胞死亡途径主要是细胞凋亡,凋亡的发生基本上不影响子代病毒粒子的复制,而病毒的复制对细胞凋亡的发生则是必须的。其次,以灭活大鳞鲆弹状病毒诱导的牙鲆(Paralichthys olivaceus)传代细胞作为检测子(tester),正常对照细胞作为驱赶子(driver),分别提取mRNA,逆转录合成双链cDNA。经两轮差减杂交,两轮抑制性PCR 扩增后,取正向差减的PCR 产物与T 载体连接,构建抑制差减cDNA 文库,随机挑取7400 余个克隆,对其中4200 多个克隆进行PCR 扩增鉴定,发现近4000 个克隆中均含有插入片段,大小在250-1000bps 之间,进一步对含有插入片段的近4000 个克隆进行了斑点杂交筛选,得到近668 个可能含有抗病毒或与免疫相关的阳性克隆。初步的结果表明所建立的差减cDNA 文库适合进一步克隆鱼类抗病毒相关新基因。第三,构建SMART-cDNA 文库并结合RACE 技术成功克隆到了cystein proteinase, decorin, NDPK, RACK, chemokine 等重要的免疫相关基因,这些基因在牙鲆中都是首次被克隆鉴别,利用对它们的RT-PCR 分析表明,不同的基因在细胞及组织上具有不同的时空分布。最后,对decorin 基因进行了进一步的重组原核表达载体的构建、原核表达、蛋白纯化、抗体制备,对肝、脾、头肾、后肾、皮肤、心、肌肉、脑、肠、鳃、卵巢、精巢等组织中的decorin 表达蛋白进行的western blot 分析表明在检测