背景黑素瘤是一种来源于皮肤黑素细胞的恶性肿瘤,虽发病率相对较低,但具有发生转移早、病死率高、致死年龄低和预后差的特点,严重威胁人类生命。在疾病早期,通过手术治疗尚可获得较好的效果,一旦进入转移期,即使经过放化疗等手段也难以得到满意疗效。因此,深入探索黑素瘤发生发展的分子机制,寻找新的治疗手段及分子靶标,对黑素瘤的临床治疗尤为重要。依巴斯汀（Ebastine）是经典的强效H1型组氨酸受体（H1-Histamine Receptor）拮抗剂,具有长效的抗组胺作用,在抗过敏、抗炎等多方面表现出色,目前是慢性荨麻疹、过敏性鼻炎和其他过敏性疾病的常用药物。越来越多的研究表明,依巴斯汀在肿瘤治疗中也发挥着重要作用,但在黑素瘤中的作用尚未有相关报道。自噬是真核细胞生物中一种“自我消化”现象,属于Ⅱ型程序性细胞死亡方式。通过清除受损或过剩的细胞器、病原体和蛋白聚集体等成分,实现细胞及组织的自我更新,维持内环境稳态和细胞存活。自噬与肿瘤的发生发展具有密切联系,可以通过促进肿瘤适应应激条件和抑制先天性和适应性免疫应答的激活来影响肿瘤与宿主之间的相互作用。多个研究证明肿瘤细胞可通过自噬降解癌蛋白,抑制肿瘤的发生和发展。寻找可以引起“自噬性死亡”的治疗药物,已成为研究热点。N6-腺苷酸（m6A）甲基化是真核细胞生物中最普遍的RNA表观遗传修饰,也是一种动态可逆的转录后修饰方式,由甲基转移酶（Writers）、去甲基化酶（Erasers）和甲基化阅读蛋白（Readers）组成。YT521-B同源结构域家族2（YTHDF2）是阅读蛋白中的重要成员,通过识别特异性m6A修饰位点,介导mRNA的降解。YTHDF2已被发现参与了多种癌症的发展,包括膀胱癌、肝细胞癌、胃癌、乳腺癌、骨肉瘤、宫颈癌、前列腺癌、胰腺癌、白血病等。目的基于目前研究发现依巴斯汀在多种肿瘤中发挥一定的治疗作用,我们将进一步明确其对黑素瘤细胞的影响作用及机制,为研究开发黑素瘤的治疗药物提供更多的理论依据。明确YTHDF2在黑素瘤组织和正常皮肤组织中的表达情况;研究YTHDF2对黑素瘤生物学行为的影响,进一步探索其调控机制,以期寻找更有效的治疗靶点。方法1.用CCK-8法检测依巴斯汀在黑素瘤细胞A375和M14中的半数抑制浓度（IC50）,同时验证其对黑素瘤细胞活力的影响。2.通过转染mCherry-EGFP-LC3B双荧光质粒检测在黑素瘤细胞中依巴斯汀对自噬流的影响,统计不同实验组中荧光斑点的数量,判断自噬流的发展。3.利用蛋白质免疫印迹检测对照组和依巴斯汀处理实验组的自噬相关蛋白（LC3和Beclin1）和AKT/mTOR通路蛋白变化,明确依巴斯汀对黑素瘤细胞自噬及信号通路的调控。4.利用免疫组织化学染色法检测YTHDF2在正常皮肤组织和黑素瘤组织中的表达情况,分析其表达水平与临床参数之间的关系。5.通过慢病毒和质粒构建YTHDF2稳定表达及YTHDF2干扰的黑素瘤细胞系,利用CCK-8和克隆形成实验检测YTHDF2对黑素瘤细胞增殖能力的影响;Transwell实验检测YTHDF2对黑素瘤细胞迁移能力的影响。6.利用ENCORI数据库预测YTHDF2的下游基因,经蛋白质免疫印迹及RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）验证,初步筛选出MCL 1作为下游靶基因。结果1.经CCK-8法测定依巴斯汀在黑素瘤细胞A375和M14中的半数抑制浓度IC50分别是 3.353μmol/L 和 3.785μmol/L,选取 2.0μmol/L 和 4.0μmol/L 依巴斯汀开展后续实验;选择2.μmol/L的药物浓度处理黑素瘤细胞进行CCK-8细胞增殖实验,与对照组（0μmol/L）相比,药物处理组的细胞活力明显降低。2.转染mCherry-EGFP-LC3B双荧光质粒后通过激光共聚焦显微镜观察:与对照组相比,依巴斯汀组黑素瘤细胞的自噬水平明显升高,自噬小体和自噬溶酶体数量均出现明显的增加。3.通过蛋白质免疫印迹结果发现:与对照组相比,经过依巴斯汀处理之后,自噬相关蛋白LC3-II/I和Beclin1表达明显升高;使用不同浓度（2.0μmol/L、4.0μmol/L）的依巴斯汀处理黑素瘤细胞后发现,p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR显著降低。4.免疫组织化学检测结果显示:在黑素瘤组织中YTHDF2的表达明显高于正常皮肤组织;统计分析表明,YTHDF2的表达水平与黑素瘤患者的年龄、性别和是否淋巴结转移无相关性。5.在黑素瘤细胞中稳定过表达YTHDF2后,相比于对照组,细胞的增殖和迁移能力明显下降;沉默YTHDF2后,黑素瘤细胞的增殖和迁移能力显著提升。6.通过ENCORI数据库和阅读文献,预测相关下游靶基因,根据蛋白质印记及RNA结合蛋白免疫沉淀结果,最终选择MCL1作为下游靶基因进行研究。结论1.依巴斯汀通过抑制AKT/mTOR通路而活化黑素瘤细胞中的自噬途径,降低黑素瘤细胞的活力。2.YTHDF2在黑素瘤组织呈现高表达;YTHDF2在黑素瘤中发挥抑制肿瘤增殖和迁移的生物学作用,并调控MCL1的表达水平。