研究背景针刺镇痛是针灸实践最广泛的领域。在欧美国家中60%以上的针灸治疗患者都是和疼痛相关;我国的针灸效能疾病谱中50%以上和疼痛相关。近年来,针灸治疗慢性疼痛取得了国际高质量的临床研究证据,实验研究揭示了针刺镇痛的部分作用机制,可以说针刺镇痛是针灸走向国际的先导,但同时也给针灸镇痛研究提出了新问题。国际针灸临床研究协作组对西方39个针刺治疗慢性疼痛的随机对照试验（randomized controlled trial,RCT）的回顾性研究提示,针刺层次直接影响镇痛疗效,深刺和浅刺都有一定的镇痛作用。另一项RCT则显示,痛阈值较高的肌纤维痛患者在采用深刺的真针刺后疼痛减轻更显著,而痛阈值较低的患者采用浅刺的假针灸的镇痛疗效更好,说明针刺镇痛效应取决于针刺强度与机体状态的结合。以上临床研究表明,刺激的深浅和强度与针灸镇痛的效果密切相关。但目前缺乏结合刺激层次和强度探讨针灸镇痛效应机制的研究。刺激深度和强度,是影响针效的关键因素,也是针灸科研工作者极为关注的基本问题。穴位不同层次刺激起效的神经传入是什么?不同强度刺激的镇痛效应及其机制有何区别?是本研究聚焦解决的关键科学问题。针灸可以激活穴区不同初级感觉传入发挥镇痛作用,不同种类神经纤维的激活依赖于不同强度的刺激。然而,深刺或浅刺到底通过激活穴区哪一层次的哪类初级感觉传入以缓解慢性疼痛,目前研究报道甚少。近年的研究证明了 A-纤维与C-纤维在慢性疼痛调节中的作用,激活深部A-纤维可抑制神经病理性疼痛引起的背根神经节中C类感觉神经元的放电;激活痛源局部皮肤C-纤维也可以抑制C类初级感觉神经元的自发电活动,从而缓解肌肉炎性痛。这些研究表明痛源局部特定强度刺激激活深浅层躯体组织的感觉传入可以产生镇痛作用,为研究针刺强度和层次与镇痛效应的关系提供了思路,也为揭示针灸局部镇痛机制奠定了基础。此外,C-纤维背根反射（dorsal root reflex of C-fibers,C-DRR）在慢性疼痛的维持和发展中起到重要作用。脊髓背角GABA（gamma-amino butyric acid,GABA）能中间神经元对C-纤维中枢末梢存在突触前抑制。那么,针刺激活不同的神经纤维是否对C-DRR存在抑制作用,还不清楚。因此,提出研究假说:不同强度电针深浅刺激或热灸样刺激痛源局部穴区通过激活皮肤或肌肉中不同种类的神经纤维,抑制深部组织的伤害性传入以及背根C-纤维逆行性传出电活动,从而缓解慢性疼痛;脊髓背角GABA能中间神经元可能参与针灸样刺激对C-DRR的调控。研究目的以慢性腓肠肌炎性痛模型大鼠为研究对象,综合应用行为学、神经电生理学、形态学,以及神经示踪、神经切断术或工具药阻断等技术,明确不同层次（肌肉或皮肤）、不同强度（激活A-纤维或C-纤维）针灸样刺激承山穴区的镇痛作用;分析参与不同层次刺激穴位缓解慢性疼痛的传入纤维类别,从肌肉伤害性传入和背根C-纤维逆行性传出两个水平探讨其镇痛机制;初步探索脊髓背角GABA能抑制性中间神经元参与电针或热灸样刺激镇痛的神经机制。研究方法第一部分:慢性肌肉炎性痛模型的建立和穴位不同刺激镇痛参数的确定采用完全弗氏佐剂（complete Freund’s adjuvant,CFA;200 μL）构建大鼠右侧腓肠肌炎性痛模型,以双足承重差值为肌肉自发疼痛指标,观察CFA注射后1-14 d双足承重差值的变化（双足承重差值=患侧后肢承重-健侧后肢承重）,研究CFA引起的肌肉炎性痛的发生发展过程。在双足承重差值最大的时间点,采用抗炎镇痛药吲哚美辛（12 mg/kg）验证该模型。同样的时间点,在痛源局部承山穴区分别行热灸样刺激（moxibustion-like stimulation,MS）包括50℃热水刺激和0.2%辣椒素（100μL）涂抹、毛刷刺激、1 mA/3 mA皮肤层电针,以及 1 mA/3 mA 肌肉层电针（deep electroacupuncture,dEA）,观察大鼠即刻双足承重差值的变化,明确不同层次和不同强度刺激痛源局部穴区的镇痛参数。第二部分:分析低强度肌肉层电针的局部镇痛机制及其外周传入采用单纤维记录支配腓肠肌的胫神经中C-纤维自发电活动,观察1 mA肌肉层电针（dEA）对C-纤维放电个数的影响。然后,记录dEA对胫神经中各类神经纤维放电的影响以鉴定dEA所激活的外周传入类型。其次,在胫神经鞘内注射眼镜蛇蛇毒（15 μg/5μL生理盐水）,透射电镜观察其对髓鞘的选择破坏以阻断肌肉A-纤维传入,借此验证dEA对C-纤维和疼痛行为的作用。最后,切断支配穴区的皮神经,观察dEA对疼痛行为的影响,以排除皮神经传入参与dEA镇痛。第三部分:探讨低强度肌肉层电针对C-DRR的调控及其可能的脊髓机制首先,借助神经逆行示踪剂确定支配腓肠肌的神经节段。在腓肠肌注射0.1%霍乱毒素 B 亚基结合荧光素 488（cholera toxin subunit B conjugated with Alexa Fluor 488,CTB 488;5μL）,观察并统计L2-6节段DRG中神经元的标记情况。然后,通过切断背根研究背根反射对神经源性炎性痛的影响。实验分为CFA+切断背根组,切断背根+CFA组和CFA+假手术组,检测大鼠双足承重差值,腓肠肌肿胀周长、重量和肌肉炎性渗出的伊文氏蓝（evens blue,EB）含量。其次,研究C-DRR介导1 mA dEA的镇痛和抗炎作用。记录肌肉炎性痛引起的C-DRR,观察dEA对背根C-纤维逆行性自发放电个数的抑制;同时检测dEA后大鼠双足承重差值,腓肠肌肿胀周长、重量和肌肉EB含量。最后,探讨脊髓背角GABA能神经元介导dEA镇痛。通过免疫荧光组织化学染色技术观察dEA对脊髓背角浅层中谷氨酸脱羧酶67阳性（glutamic acid decarboxylase,GAD67+）抑制性中间神经元和P物质阳性（substance P,SP+）C-纤维中枢末梢的影响,并统计其荧光强度;在脊髓表面滴加GABA A受体的阻断剂荷包牡丹碱（5 μg/15 μL人工脑脊液）,验证dEA的镇痛和抗炎作用。第四部分:分析热灸样刺激的局部镇痛机制及其感觉传入采用单纤维记录支配腓肠肌的胫神经中C-纤维自发电活动,观察热灸样刺激（MS）对C-纤维放电个数的影响。然后,分析MS的外周神经传入,采用免疫荧光组织化学染色技术观察MS对穴区皮肤中SP+和降钙素基因相关肽阳性（calcitonin gene related peptide,CGRP+）C-纤维终末的表达,并观察 MS对支配穴区的皮神经中C-纤维的激活。最后,借助神经切断术探讨MS镇痛的外周神经机制。切断支配穴区的皮神经,观察MS对皮肤C-纤维,肌肉C-纤维和疼痛行为的作用。第五部分:探讨热灸样刺激对C-DRR的调控及其可能的脊髓机制首先,记录肌肉痛引起的C-DRR并观察MS对其自发放电个数的抑制。然后,通过免疫荧光组织化学染色观察MS对脊髓背角浅层中GAD67+神经元和SP+C-纤维中枢终末的影响。最后,脊髓表面滴加荷包牡丹碱后,观察MS对疼痛行为的影响。研究结果第一部分:不同强度深浅刺激承山穴对腓肠肌炎性痛的镇痛参数确定右侧腓肠肌注射CFA后,第1天大鼠双足承重差值明显增大（P＜0.01）,说明患肢出现疼痛,到第5天疼痛最显著（P＜0.0001）,而抗炎镇痛药吲哚美辛可显著缓解疼痛（P＜0.01）,证明CFA引起的肌肉炎性痛模型建立成功。在造模后第5天,穴区皮肤大面积热灸样刺激（MS）后,双足承重差值显著降低（P＜0.01）,表明MS镇痛作用显著;给予1 mA肌肉层电针（dEA）后,亦可显著缓解疼痛（P＜0.001）。而刷毛等非伤害性刺激皮肤、高低强度皮肤层电针或3 mA肌肉层电针均无明显镇痛作用。以上结果说明,MS或1 mA dEA均可显著缓解肌肉炎性痛。第二部分:低强度肌肉层电针可激活肌肉A-纤维,抑制肌肉炎症引起的C-纤维自发电活动,改善疼痛行为CFA注射5天后,可在支配腓肠肌的胫神经记录到明显的C-纤维自发电活动（49.8±12.1/min）,1 mA dEA 后其自发放电明显减少（14.4±5.9/min,P＜0.05）,说明此强度dEA可以抑制炎性痛引起的C-纤维自发电活动。单纤维记录观察到1 mA dEA可激活肌肉中大量A-纤维传入,而在胫神经鞘内注射蛇毒破坏A-纤维的髓鞘后,dEA对C-纤维自发电活动和疼痛行为的抑制作用都消失,说明肌肉A-纤维介导了 dEA镇痛。但是,切断支配穴区的皮神经对dEA镇痛作用没有影响。以上结果证明,低强度肌肉层电针通过激活肌肉A-纤维,而不是皮肤传入,抑制深部C-纤维自发放电发挥镇痛作用。第三部分:低强度肌肉层电针可抑制L4背根中C-纤维逆行性传出电活动,减轻肌肉炎性肿胀和疼痛,和激活脊髓背角GABA能中间神经元有关通过CTB 488逆行标记,观察到L4 DRG标记的小型神经元数量最多,因此选择L4背根记录C-DRR。在CFA大鼠L4背根可记录到明显的C-DRR的自发电活动（38.2±10.0/min）,1 mA dEA后其自发放电明显下降（11.5±3.4/min,P＜0.05）。同时,我们也观察到腓肠肌炎性渗出的EB含量明显下降（P＜0.05）,腓肠肌肿胀周长和腓肠肌重量也均明显下降（P＜0.01,P＜0.0001）,说明dEA可以抑制C-DRR并缓解肌肉炎性痛和局部炎性肿胀。而切断L4背根后,大鼠肌肉疼痛和肌肉炎症均显著缓解（P＜0.01）,说明C-DRR参与了炎性痛和局部肿胀。在脊髓表面滴加荷包牡丹碱阻断GABA A受体后,dEA对疼痛行为的改善和对炎症的缓解消失,说明脊髓背角GABA A受体介导了 dEA的镇痛抗炎效应。此外,采用免疫荧光组织化学染色方法,用GAD67标记了脊髓Ⅱ板层的GABA能神经元,观察到dEA后GAD67+神经元的荧光强度明显增强（P＜0.0001）,说明dEA可以激活背角GABA能中间神经元;dEA后SP标记的C-纤维中枢末梢的荧光强度明显减弱（P＜0.05）,说明dEA可以抑制SP+C-纤维的表达。以上结果证明脊髓背角GABA能中间神经元参与了 1 mA dEA对C-DRR的调控,从而产生镇痛抗炎作用。第四部分:热灸样刺激可激活皮肤C-纤维,抑制肌肉C-纤维自发放电产生镇痛作用在肌肉炎性痛大鼠记录到的C-纤维自发电活动也可被热灸样刺激（MS）显著抑制（42.1±5.4 vs 22.6±7.0/min,P＜0.05）。且MS刺激后,可在皮神经中记录到C-纤维大量传入放电,穴区皮肤中SP+/CGRP+ C-纤维终末的表达明显增加（P＜0.0001）,说明MS激活了皮肤中的C-纤维。而切断皮神经后,MS对皮肤C-纤维的激活、肌肉C-纤维的自发电活动的抑制以及疼痛行为的改善均消失,说明皮肤C-纤维介导了 MS镇痛。以上结果证明,MS通过激活皮肤C-纤维抑制炎性肌肉C-纤维传入放电,缓解疼痛行为。第五部分:热灸样刺激抑制C-纤维背根反射,可能与脊髓背角GABA能神经元的激活有关热灸样刺激也可明显减弱肌肉炎性痛引起的C-DRR自发放电（40.9±5.8 vs 20.6±5.9/min,P＜0.05）。MS后脊髓Ⅱ板层GAD67+神经元的荧光强度明显增加（P＜0.05）,SP+C-纤维中枢末梢的荧光强度则显著减弱（P＜0.0001）;同样,阻断GABA A受体后,MS对疼痛行为的改善消失。以上说明MS激活了脊髓背角GABA能中间神经元,减少了脊髓背角神经末梢伤害性神经肽的释放,抑制了 C-DRR自发电活动,缓解疼痛。研究结论痛源局部穴区低强度肌肉层电针承山穴或大面积热灸样刺激可以改善肌肉炎性痛,前者通过激活肌肉A-纤维,后者通过激活皮肤C-纤维来抑制炎性肌肉引起的背根反射活动,减轻肌肉C-纤维的自发放电,产生镇痛作用。脊髓背角GABA能中间神经元的激活介导了二者的镇痛作用。