水华或藻华是水体中某些藻类大量繁殖,产生藻毒素和异味物质,严重影响水体生态系统、环境安全和人类健康的一种有害生态现象。由于人类社会活动的增加和全球气候急剧变化,水华在世界范围内广泛发生。我国多个湖泊、库区也频频发生水华,其优势藻类多为微囊藻、鱼腥藻、束丝藻、颤藻等蓝藻,其中铜绿微囊藻是常见的主要优势藻种之一。水华的爆发不仅受到水体营养程度、气候条件的影响,同时也与其他生物因子紧密相关。近年来许多研究表明藻类可与其他的微生物发生有益或有害的物种相互作用,其生长与形态发育受到显著影响,继而对水华的爆发和消退具有重要作用。因此研究藻类与其他微生物之间的相互作用对深入理解水体中复杂的微生物种间关系,防控水华的爆发具有重要意义。前期研究中,我们从武汉南湖水华爆发时期的水样中分离到一株丛毛单胞菌科细菌WR11,对铜绿微囊藻具有较强的抑制效果,在自然环境中可能对水华的生消过程具有重要影响,两者的相互作用值得深入研究。本研究中,我们结合微生物学技术和多组学手段,利用该丛毛单胞菌及其溶藻功能丢失突变体,初步探索了该细菌对微囊藻抑制作用的机理。本研究主要结果如下:(1)WR11对铜绿微囊藻的抑制及其受环境条件的影响。该溶藻菌与铜绿微囊藻于全光照条件共培养时,初期出现较好溶藻效果,使铜绿微囊藻的细胞破裂并释放藻细胞内容物,从而导致藻细胞死亡,提高细菌接种比例会增强溶藻效果;在共培养后期,单独培养的铜绿微囊藻对照组逐渐出现衰亡,而共接种细菌的藻细胞又逐渐恢复生长,并且可以维持良好的生长状态,呈现出一种促生的菌藻关系。而在短光照或12h光照/12h黑暗共培养时,该细菌可以维持较长时间的溶藻效果。这些结果暗示了光照条件对丛毛单胞菌科细菌与铜绿微囊藻相互作用的形式具有调控作用。(2)溶藻功能丢失突变体的表型研究。分离到一株丢失了溶藻能力的自发突变体M20,该突变体菌落色泽浅于野生型,对铜绿微囊藻无明显溶藻能力。溶藻菌野生型WR11的上清和破碎物均具有溶藻效果,而突变体M20的上清无溶藻效果,其破碎物却具有溶藻效果,表明野生型细菌可能分泌溶藻物质到细胞外。对两株菌的上清进行HPLC扫描和LC-MS检测,结果显示,在WR11上清中于430nm处显著出现吸收峰,而M20的上清则无此吸收峰,该化合物的具体分子结构与溶藻能力还需要进一步确定。(3)WR11的基因组测序分析。对WR11与M20进行三代基因组测序,得到完整基因序列和基因组图谱;16S rRNA基因序列分析结果表明WR11的与Paucibacter属的同源性高达97.04%。WR11与M20基因组序列对比结果揭示出野生型和突变型存在多处点突变或缺失突变,为后续寻找关键突变基因提供了分析靶点。(4)WR11与铜绿微囊藻相互作用的蛋白质组学研究。设置铜绿微囊藻对照、WR11与铜绿微囊藻共培养、M20与铜绿微囊藻共培养以及WR11和M20单独培养等共五组样品,利用高分辨液相色谱-串联质谱进行蛋白质组学分析。结果表明,铜绿微囊藻与WR11共培养时,溶藻菌显著影响微藻的膜蛋白合成、光系统的组装,这和前期显微镜观察结果一致;另一方面,该溶藻菌也对铜绿微囊藻的光合系统产生一定影响,也可能参与抑制藻的生长。通过分析WR11与M20蛋白质组表达,结果表明WR11的外膜蛋白、ABC转运蛋白、II型分泌系统蛋白等表达显著高于M20,这和其溶藻能力之间可能存在联系。综上所述,本研究利用微生物学、基因组学和蛋白质组学等方法对丛毛单胞菌科细菌WR11抑制铜绿微囊藻的机制进行了初步研究,并探讨了环境因子如光照因素对于该菌藻相互作用关系的调控影响。本实验结果将为后续深入研究该溶藻机制提供有益依据,并有助于深入理解水体中复杂的微生物种间关系与水华爆发之间的联系。