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背景:缺血性脑卒中主要是由于脑组织局部血流灌注突然减少或完全中断,导致由神经元、胶质细胞及血管内皮细胞共同组成的神经血管单元(Neurovascular Unit,NVU)受损,最终导致神经功能障碍。星形胶质细胞作为NVU的重要组成部分,在脑缺血/再灌注后通过多种机制维持神经元的结构和功能。由星形胶质细胞缝隙连接蛋白43(connexin43,C_x43)构成的半通道和缝隙连接(gap junction,GJ)已被证明在脑缺血/再灌注损伤中通过传递各种有益或有害的信息而发挥重要作用。最近的研究发现C_x43可以调节自噬的发生,而此功能与其胞间通讯功能无关。我们前期研究也发现从细胞膜转移至线粒体的C_x43可以通过稳定脑缺血后线粒体的功能从而发挥保护作用。鉴于线粒体是细胞能量代谢的重要场所,我们认为C_x43对于线粒体功能的调节是其抗脑缺血/再灌注损伤的重要方面。因此,作为细胞清除受损或者功能障碍的线粒体的重要方式——线粒体自噬,走入了我们关注的视线。然而,线粒体自噬在脑缺血/再灌注中扮演的角色及其是否参与C_x43对线粒体功能的调节尚未见明确报道。本研究旨在探讨干预星形胶质细胞C_x43在脑缺血/再灌注损伤中对线粒体自噬的调控及机制,并明确其对神经元存活的影响,为缺血性脑卒中的治疗提供新靶点。目的:观察星形胶质细胞线粒体自噬在脑缺血/再灌注损伤中的变化规律;探讨星形胶质细胞C_x43对线粒体自噬的影响及机制;明确干预由C_x43主导的线粒体自噬对缺血性神经元损伤是否有保护作用。方法:体外培养新生C57BL/6小鼠大脑皮层星形胶质细胞及神经元,采用Transwell小室构建星形胶质细胞与神经元共培养体系,制作糖氧剥夺/复糖复氧模型(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)模拟体外脑缺血/再灌注损伤。1、设置单独培养神经元组(Neuron)以及星形胶质细胞与神经元共培养组(Co-culture)在OGD/R各时间点采用CCK-8法检测神经元的存活率;对单独培养的星形胶质细胞设置OGD/R各时间点,采用Western blot检测自噬标志蛋白LC3-II/I比值、p62及线粒体外膜蛋白TOMM20的表达;之后选择OGD4h/R24h作为实验时间点,并使用自噬激活剂雷帕霉素(rapamycin,RAPA)干预,采用Western blot检测星形胶质细胞内TOMM20及C_x43蛋白的表达、免疫荧光染色观察LC3B与C_x43或TOMM20的共定位、透射电镜观察线粒体自噬体、CCK-8法检测细胞存活率。2、使用C_x43 si RNA转染星形胶质细胞,设置对照组(Con)、C_x43敲低组(C_x43KD)、糖氧剥夺/复糖复氧组(OGD/R)、糖氧剥夺/复糖复氧+C_x43敲低组(OGD/R+C_x43KD),对星形胶质细胞采用CCK-8法检测存活率、激光共聚焦显微镜和荧光酶标仪对加载JC-1探针后线粒体膜电位进行定性和定量分析、酶标仪检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)及释放至胞外上清液中的一氧化氮(nitric oxide,NO);并采用CCK-8及TUNEL染色分别检测共培养体系中神经元存活率、凋亡率;进而检测星形胶质细胞内线粒体自噬情况,采用Western blot检测TOMM20及TIMM23的表达、透射电镜观察线粒体自噬体、激光共聚焦显微镜观察加载活细胞探针后线粒体及溶酶体的共定位;采用Western blot检测星形胶质细胞线粒体自噬途径PINK1及FUNDC1。3、使用C_x43腺病毒过表达载体、PINK1 si RNA转染星形胶质细胞,设置糖氧剥夺/复糖复氧组(OGD/R)、糖氧剥夺/复糖复氧+C_x43过表达组(OGD/R+C_x43 OE)、糖氧剥夺/复糖复氧+PINK1敲低组(OGD/R+PINK1 KD)、糖氧剥夺/复糖复氧+C_x43过表达+PINK1敲低组(OGD/R+C_x43 OE+PINK1 KD),首先采用Western blot、透射电镜、活细胞探针验证C_x43通过PINK1途径调控星形胶质细胞的线粒体自噬;进而检测星形胶质细胞的存活率、线粒体膜电位、细胞内ROS及释放至胞外的NO,并检测共培养体系中神经元的存活率及凋亡率。结果:1、星形胶质细胞与神经元共培养在OGD/R各个时间点均能显著提高神经元的存活率(P<0.01);其中,在OGD4h/R24h,共培养可将神经元的存活率由32%提高至50%左右(P<0.001),此时间点为进一步研究的最佳状态。2、在OGD 8h内,与Con组相比,星形胶质细胞内LC3-II/I比值均明显升高(P<0.05),p62及TOMM20蛋白的表达不同程度降低(P<0.01);在OGD4h/R(0-24)h,与Con组相比,LC3-II/I比值不同程度升高,p62与TOMM20蛋白的表达在各时间点均显著下降(P<0.01)。以OGD4h/R24h为实验时间点,星形胶质细胞内TOMM20及C_x43蛋白的表达在OGD/R后显著降低(P<0.001);免疫荧光染色显示LC3B的表达以及其与TOMM20的共定位增强,C_x43的分布由以细胞膜为主转变为细胞质为主,并与LC3B的共定位增强;透射电镜观察到星形胶质细胞内线粒体自噬体明显增多。与OGD/R组相比,RAPA干预使TOMM20及C_x43的蛋白表达进一步降低(P<0.05),线粒体自噬体明显增多,TOMM20与LC3B的共定位进一步增强,星形胶质细胞存活显著改善(P<0.01)。3、与Con组相比,OGD/R组星形胶质细胞的存活率及线粒体膜电位明显下降(P<0.001),细胞内ROS及释放至细胞外上清液中的NO明显增多(P<0.001);与OGD/R组相比,敲低C_x43的星形胶质细胞在OGD/R后,细胞存活率及线粒体膜电位进一步降低(P<0.05),而细胞内ROS及胞外NO显著增多(P<0.01)。共培养体系中,OGD/R组与Con组相比,神经元的存活率明显下降(P<0.001),同时凋亡率升高(P<0.01);而敲低C_x43加剧了共培养体系中神经元的上述变化(P<0.01)。4、与Con组相比,OGD/R组星形胶质细胞TOMM20及TIMM23蛋白的表达明显减少(P<0.001),透射电镜观察到线粒体自噬体明显增多,激光共聚焦显微镜观察到使用探针标记的线粒体及溶酶体共定位增强,PINK1及FUNDC1蛋白的表达明显增多(P<0.01);与OGD/R组相比,敲低C_x43的星形胶质细胞在OGD/R后,TOMM20及TIMM23蛋白的表达明显增多(P<0.05),线粒体自噬体以及线粒体与溶酶体的共定位减少,PINK1蛋白的表达明显减少(P<0.01),而FUNDC1蛋白的表达无明显变化(P>0.05)。5、过表达C_x43的星形胶质细胞在OGD/R后,TOMM20及TIMM23的表达显著减少(P<0.01),线粒体自噬体明显增多,线粒体及溶酶体的共定位增强,PINK1蛋白的表达明显增多(P<0.001);而过表达C_x43在OGD/R后的上述作用则在敲低PINK1后被逆转(P<0.01)。6、过表达C_x43的星形胶质细胞在OGD/R后,自身存活率及线粒体膜电位明显升高(P<0.05),而胞内ROS及胞外NO显著降低(P<0.01);共培养体系中,与OGD/R组相比,过表达星形胶质细胞C_x43提高了神经元的存活率(P<0.001)并降低了凋亡率(P<0.01)。敲低PINK1逆转了过表达C_x43在OGD/R后的上述作用(P<0.05)。结论:1、星形胶质细胞的线粒体自噬在OGD/R后增强,是星形胶质细胞抵抗OGD/R损伤的一种保护性机制。2、星形胶质细胞C_x43对OGD/R后自身及神经元的存活具有保护作用,这种保护作用是C_x43通过调控PINK1途径诱导线粒体自噬从而稳定线粒体功能实现的。