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β-内酰胺类抗生素是目前世界上使用最为广泛的一类抗感染药物。半合成β-内酰胺类抗生素是其中最重要的一类。半合成抗生素一般由两步来合成:通过天然发酵产物的水解,人们得到了各种β-内酰胺母核;然后,母核与不同的侧链缩合形成了品种繁多的半合成抗生素。在β-内酰胺类抗生素生产中,由于庞大的市场容量和日益严格的环境要求,人们不断推动生物酶法来替代传统的化学法,以实现合成工艺的升级换代。D-氨基酸氧化酶和青霉素酰化酶是两种重要的抗生素合成用酶,也是本文的主要研究对象。 (1)D-氨基酸氧化酶的分子改造及其应用 来自变异三角酵母的D-氨基酸氧化酶(TvDAO)是目前抗生素工业上最常用的D-氨基酸氧化酶。对于它的工业应用,人们首先需要克服的是酶蛋白发酵产量低的问题。通过对表达载体和酶切位点的优化,选择了不带标签的pET-28a作为表达载体,TvDAO的可溶性有了部分提高。然后对组氨酸标签进行了优化,发现TvDAO在N端融合4-6个氨基酸长度的组氨酸标签后(NHDAO),可以实现酶的完全可溶性表达和提高辅酶FAD结合,但对宿主菌的细胞毒性也大幅度增加。表明N端额外序列的添加对TvDAO重组蛋白的表达有复杂的影响。同时,还对TvDAO进行了改造,提高了它对底物CPC的催化活力。 通过对诱导剂的筛选,发现当乳糖替代IPTG时,可以有效的解除NHDAO表达对宿主菌生长的毒性,并进一步将辅酶FAD的结合率提高到95%以上。说明DAO的全酶比例决定于酶本身的特性和培养条件的综合作用。通过使用营养丰富的合成培养基,并将培养基中的组分进行国产化替代和浓度优化,酶活进一步上升,同时成本大幅度降低。在3.7L发酵罐上放大时,通过进一步补加碳源,酶活超过摇瓶水平,达到140 U/ml,比活达到16.68 U/mg,占总蛋白的41.4%。2.8g/L·day的活性蛋白产率也超过了生物转化对催化剂制备经济性的要求。从发酵优化的过程来看,大肠杆菌中的D-氨基酸氧化酶表达,存在对碳源供应的明显依赖性。DAO对细菌生长必需的D-氨基酸的氧化降解,可能增加了氨基酸合成的还原力需求。 将发酵得到粗酶液在处理后固定化到环氧基载体上。优化后的固定化条件是:20℃,pH8.0-8.5,盐浓度是1M,投酶量是150U/g载体,固定化时间是3小时,酶活达到29.44U/ml,超过了商品酶的酶活水平。酶学性质鉴定表明,固定化酶的温度稳定性超过了游离酶。将固定化酶用于催化CPC的氧化,GL-7-ACA的产率为80%。50批次催化实验后计算得到酶的半衰期为111小时。 (2)青霉素G酰化酶的分子改造及其应用 粪产碱杆菌的青霉素G酰化酶(Af PGA)是目前半合成抗生素合成最常用的三种青霉素G酰化酶之一。要将Af PGA用于半合成抗生素合成,首先要增加其合成水解比和对酰基供体的催化效率。以野生型AfPGA为模板,选取其中的3个保守位点(βF24,αR146,αF147),构建了饱和突变文库,通过两轮筛选,得到了来自βF24文库的四个突变子。将突变酶加上组氨酸标签纯化后,对他们的稳态动力学参数和氨苄西林合成的过程参数进行了测定。发现24位突变后,酶对C-α取代的底物的选择性增加,同时酶对不同形式酰基供体的偏爱性发生改变。揭示在对PGA改造时,应综合考虑用作筛选的反应类型(特别是酰基供体种类)。最为优秀的是βF24G突变的Af PGA。其对酰基供体D-苯甘氨酸甲酯(D-PGME)的催化效率增加了800倍,同时对苯乙酸耐受性增加,在抗生素合成过程中的三个参数都优于野生型。将βF24G游离酶用于氨苄西林的合成,相对于野生型,初始合成水解比提高了8.6倍,6-APA转化率提高到95%,同时投酶量和反应时间大幅度降低。表明酶法合成半合成抗生素,取决于酶与特定反应类型的结合。 将βF24G突变的Af PGA部分纯化后,固定化到环氧基载体上,在高底物浓度和低酰基供体对母核比例(1.05∶1)下,合成氨苄西林。优化后的反应条件是:15%(v/v)的甘油,0.04g/ml固定化突变Af PGA,pH5.8,20℃C。在此条件下反应,6-APA的转化率由优化前的不到70%增加到93.5%,反应时间为600分钟。证明作为绿色溶剂的甘油可以促进氨苄西林的酶法合成。综合利用野生型酶和突变子的各自催化优势,构建了野生酶和突变酶催化的双酶两步直接合成氨苄西林的工艺,以减少母核6-APA的分离纯化步骤。第一步野生酶催化的水解反应的时间是45分钟,产率是97%。突变酶催化的第二步合成反应,优化后的反应条件是:0.19 g/ml固定化突变AfPGA,pH6.3,28℃C,D-PGME/6-APA浓度比例是1.50∶1。反应时间是235分钟,转化率为90%。总的反应时间是280分钟,转化率是87%。同时,每摩尔的氨苄西林的产生只需要不到1.7摩尔D-PGME,更加符合绿色化学对原子经济性的要求。说明改进后的青霉素酰化酶,不仅可以用于对现有工艺途径的优化,也可以引导新的抗生素合成工艺的开发。