目的：　　我们拟通过细胞实验和动物实验研究胃癌来源的exosomes（外泌体）对腹膜转移前微环境的调节及对腹膜转移的作用，并对具体机制进行了深入探讨，将为胃癌腹膜转移发生发展提供新的视角。　　方法:　　本研究采用差速离心法及ExoQuick试剂法提取exosomes，利用电子显微镜观察其形态，荧光共聚焦显微镜及相差显微镜观察exosomes内化过程、MMT过程以及粘附状态，MTT法测定细胞活力，光学显微镜观察细胞和腹膜形态，免疫印迹法检测Flotillin-1、CD9、PARP、Procaspase-3、cleaved-caspase-3、Zo-1、Vimentin、p-ERK、ERK、FN和Actin等蛋白的表达，TUNEL染色原位检测细胞凋亡。统计学处理:每次实验重复3次，数据以均值±标准差（(x)±s）表示。最终采用SPSS17.0统计软件进行t检验，P＜0.05有统计学意义。　　结果:　　1、胃癌来源exosomes的鉴定和内化。　　收集胃癌MGC803细胞培养上清，利用差速离心法或ExoQuick-TCTM试剂提取exosomes。电子显微镜证实MGC803细胞分泌的exosomes呈现典型的圆形或卵圆形，直径波动在30nm至100nm之间。免疫印迹实验检测exosomes标志蛋白，和来源细胞比较，exosomes高表达Flotillin-1、CD9，而不表达阴性对照蛋白“Calreticulin”（钙网蛋白），结果与文献报道一致。利用红色荧光染料DID标记exosomes，和腹膜间皮细胞（HMrSV5细胞）共同孵育后在荧光共聚焦显微镜及相差显微镜下记录exosomes的内化状态。结果显示:红色荧光分散在胞浆中，而对照组未检测到荧光。这表明，我们成功地从胃癌细胞培养上清中提取了exosomes，且exosomes可被靶细胞有效摄取。　　2、胃癌来源exosomes通过破坏腹膜间皮屏障、诱导腹膜纤维化而促进胃癌腹膜转移。　　选取4-6周龄雄性裸鼠，随机分为实验组和对照组，腹腔内隔日注射胃癌MGC803细胞分泌的exosomes(50μg/0.5ml PBS)和无菌PBS，1周后处死小鼠，收集腹膜并制成石蜡切片。光学显微镜下观察到，PBS处理组小鼠腹膜表面被覆的间皮层保持完整，而exosomes处理组，小鼠腹膜被广泛破坏，导致间皮下结缔组织不同程度地暴露于腹腔。同时，我们在exosomes处理组看到伴随着腹膜屏障受损腹膜亦明显增厚、呈纤维化改变。结果提示，胃癌来源的exosomes在转移前龛形成中发挥了重要作用。当小鼠腹腔用exosomes预处理后再注射瘤细胞，转移瘤结节总重量较对照组明显增加。这提示，胃癌来源的exosomes很可能通过破坏间皮屏障、诱导纤维化微环境而加速腹膜转移。　　3、胃癌来源exosomes通过凋亡和MMT促进腹膜间皮细胞损伤。　　HMrSV5细胞以4000个/孔的密度种在96孔板中，贴壁过夜，加入不同浓度的胃癌MGC803分泌的exosomes作用不同时间点。MTT实验证实exosomes以时间和浓度依赖特性引起腹膜间皮细胞损伤。胃癌exosomes处理HMrSV5细胞后，蛋白印迹实验显示PARP及caspase-3均存在不同程度的裂解。AnnexinⅤ-PI流式双染法结果示，和对照组比较，200、400μg/ml exosomes处理组，HMrSV5细胞凋亡比例增加了8.3％和13.8％，进一步证实了exosomes能以浓度依赖方式促进腹膜间皮细胞凋亡。不仅如此，胃癌exosomes同时引起HMrSV5细胞形态发生间质样改变，而PBS处理组仍保持铺路石样外观。蛋白印迹实验证实，给予胃癌exosomes处理后HMrSV5细胞紧密连接蛋白（Zo-1）显著下调，而波形蛋白(Vimentin)、基质蛋白如纤连蛋白(Fibronectin)和Ⅰ型胶原蛋白(Collogen-Ⅰ)则明显上调。免疫荧光染色结果亦显示，定位于膜周的Zo-1蛋白溶解、减少，而中间纤维Vimentin显著增加。此外，我们还对exosomes处理过的腹膜进行了TUNEL染色和免疫荧光双重染色，分别体内验证了胃癌exosomes引起的腹膜间皮细胞凋亡和MMT现象。上述结果表明，胃癌来源的exosomes能同时诱导腹膜间皮细胞凋亡及MMT。　　4、ERK通路在胃癌来源exosomes促进腹膜间皮细胞损伤中发挥的作用。　　免疫印迹实验检测到MGC803细胞分泌的exosomes引起HMrSV5细胞ERK通路显著活化。应用或不应用PD98059（ERK1/2抑制剂，25μM）预处理HMrSV5细胞2小时，流式实验显示，exosomes组和PBS组HMrSV5细胞凋亡率无明显差别。同时，抑制ERK通路后exosomes诱导的HMrSV5细胞形态变化及Zo-1下调、Vim上调都存在部分逆转。这些结果提示，ERK通路主要参与胃癌exosomes诱导腹膜间皮细胞的MMT过程，对凋亡作用甚微。这也意味着，由同一外界刺激—胃癌exosomes引起的腹膜间皮细胞凋亡和MMT可能是相对独立的过程，存在不同的信号调控路径。　　5、胃癌来源exosomes通过诱导腹膜间皮细胞FN沉积而促进腹膜粘附　　用不同浓度的MGC803细胞分泌的exosomes处理HMrSV5细胞，免疫印迹和免疫荧光实验检测纤连蛋白FN的表达变化。结果提示，胃癌exosomes能以浓度依赖方式上调FN的表达。同时，利用免疫印迹技术检测到多种胃癌细胞系的整合素integrinα5和integrinβ1均呈高表达状态。MGC803细胞分泌的exosomes作用HMrSV5细胞一定时间后，荧光共聚焦显微镜及相差显微镜记录胃癌细胞粘附情况，结果显示，exosomes处理组对比PBS处理组腹膜间皮单层的粘附能力明显增强。上述结果表明，胃癌来源exosomes很可能通过诱导腹膜间皮细胞FN沉积而促进腹膜粘附。　　6、ERK/AKT/STAT3通路参与胃癌exosomes诱导的腹膜间皮细胞FN合成　　MGC803细胞分泌的exosomes处理HMrSV5细胞不同时间点(0、15min、30min、1h、3h、6h、12h)，结果示，ERK及AKT通路呈持续性活化，而STAT3通路则呈一过性活化。给予ERK抑制剂PD98059(25μM)，AKT抑制剂LY294002(20μM)及STAT3抑制剂Stattic(2μM)预处理2小时，免疫印迹实验证实胃癌exosomes诱导的FN上调均被明显抑制。这些结果提示，ERK/AKT/STAT3通路是胃癌exosomes诱导腹膜间皮细胞FN合成的重要信号通路。　　结论:　　1、胃癌exosomes通过破坏间皮屏障，诱导腹膜纤维化而促进腹膜转移。　　2、胃癌exosomes通过凋亡和MMT机制促进腹膜间皮细胞损伤。　　3、胃癌exosomes通过诱导FN沉积而促进腹膜粘附。