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目的: 我们拟通过细胞实验和动物实验研究胃癌来源的exosomes(外泌体)对腹膜转移前微环境的调节及对腹膜转移的作用,并对具体机制进行了深入探讨,将为胃癌腹膜转移发生发展提供新的视角。 方法: 本研究采用差速离心法及ExoQuick试剂法提取exosomes,利用电子显微镜观察其形态,荧光共聚焦显微镜及相差显微镜观察exosomes内化过程、MMT过程以及粘附状态,MTT法测定细胞活力,光学显微镜观察细胞和腹膜形态,免疫印迹法检测Flotillin-1、CD9、PARP、Procaspase-3、cleaved-caspase-3、Zo-1、Vimentin、p-ERK、ERK、FN和Actin等蛋白的表达,TUNEL染色原位检测细胞凋亡。统计学处理:每次实验重复3次,数据以均值±标准差((x)±s)表示。最终采用SPSS17.0统计软件进行t检验,P<0.05有统计学意义。 结果: 1、胃癌来源exosomes的鉴定和内化。 收集胃癌MGC803细胞培养上清,利用差速离心法或ExoQuick-TCTM试剂提取exosomes。电子显微镜证实MGC803细胞分泌的exosomes呈现典型的圆形或卵圆形,直径波动在30nm至100nm之间。免疫印迹实验检测exosomes标志蛋白,和来源细胞比较,exosomes高表达Flotillin-1、CD9,而不表达阴性对照蛋白“Calreticulin”(钙网蛋白),结果与文献报道一致。利用红色荧光染料DID标记exosomes,和腹膜间皮细胞(HMrSV5细胞)共同孵育后在荧光共聚焦显微镜及相差显微镜下记录exosomes的内化状态。结果显示:红色荧光分散在胞浆中,而对照组未检测到荧光。这表明,我们成功地从胃癌细胞培养上清中提取了exosomes,且exosomes可被靶细胞有效摄取。 2、胃癌来源exosomes通过破坏腹膜间皮屏障、诱导腹膜纤维化而促进胃癌腹膜转移。 选取4-6周龄雄性裸鼠,随机分为实验组和对照组,腹腔内隔日注射胃癌MGC803细胞分泌的exosomes(50μg/0.5ml PBS)和无菌PBS,1周后处死小鼠,收集腹膜并制成石蜡切片。光学显微镜下观察到,PBS处理组小鼠腹膜表面被覆的间皮层保持完整,而exosomes处理组,小鼠腹膜被广泛破坏,导致间皮下结缔组织不同程度地暴露于腹腔。同时,我们在exosomes处理组看到伴随着腹膜屏障受损腹膜亦明显增厚、呈纤维化改变。结果提示,胃癌来源的exosomes在转移前龛形成中发挥了重要作用。当小鼠腹腔用exosomes预处理后再注射瘤细胞,转移瘤结节总重量较对照组明显增加。这提示,胃癌来源的exosomes很可能通过破坏间皮屏障、诱导纤维化微环境而加速腹膜转移。 3、胃癌来源exosomes通过凋亡和MMT促进腹膜间皮细胞损伤。 HMrSV5细胞以4000个/孔的密度种在96孔板中,贴壁过夜,加入不同浓度的胃癌MGC803分泌的exosomes作用不同时间点。MTT实验证实exosomes以时间和浓度依赖特性引起腹膜间皮细胞损伤。胃癌exosomes处理HMrSV5细胞后,蛋白印迹实验显示PARP及caspase-3均存在不同程度的裂解。AnnexinⅤ-PI流式双染法结果示,和对照组比较,200、400μg/ml exosomes处理组,HMrSV5细胞凋亡比例增加了8.3%和13.8%,进一步证实了exosomes能以浓度依赖方式促进腹膜间皮细胞凋亡。不仅如此,胃癌exosomes同时引起HMrSV5细胞形态发生间质样改变,而PBS处理组仍保持铺路石样外观。蛋白印迹实验证实,给予胃癌exosomes处理后HMrSV5细胞紧密连接蛋白(Zo-1)显著下调,而波形蛋白(Vimentin)、基质蛋白如纤连蛋白(Fibronectin)和Ⅰ型胶原蛋白(Collogen-Ⅰ)则明显上调。免疫荧光染色结果亦显示,定位于膜周的Zo-1蛋白溶解、减少,而中间纤维Vimentin显著增加。此外,我们还对exosomes处理过的腹膜进行了TUNEL染色和免疫荧光双重染色,分别体内验证了胃癌exosomes引起的腹膜间皮细胞凋亡和MMT现象。上述结果表明,胃癌来源的exosomes能同时诱导腹膜间皮细胞凋亡及MMT。 4、ERK通路在胃癌来源exosomes促进腹膜间皮细胞损伤中发挥的作用。 免疫印迹实验检测到MGC803细胞分泌的exosomes引起HMrSV5细胞ERK通路显著活化。应用或不应用PD98059(ERK1/2抑制剂,25μM)预处理HMrSV5细胞2小时,流式实验显示,exosomes组和PBS组HMrSV5细胞凋亡率无明显差别。同时,抑制ERK通路后exosomes诱导的HMrSV5细胞形态变化及Zo-1下调、Vim上调都存在部分逆转。这些结果提示,ERK通路主要参与胃癌exosomes诱导腹膜间皮细胞的MMT过程,对凋亡作用甚微。这也意味着,由同一外界刺激—胃癌exosomes引起的腹膜间皮细胞凋亡和MMT可能是相对独立的过程,存在不同的信号调控路径。 5、胃癌来源exosomes通过诱导腹膜间皮细胞FN沉积而促进腹膜粘附 用不同浓度的MGC803细胞分泌的exosomes处理HMrSV5细胞,免疫印迹和免疫荧光实验检测纤连蛋白FN的表达变化。结果提示,胃癌exosomes能以浓度依赖方式上调FN的表达。同时,利用免疫印迹技术检测到多种胃癌细胞系的整合素integrinα5和integrinβ1均呈高表达状态。MGC803细胞分泌的exosomes作用HMrSV5细胞一定时间后,荧光共聚焦显微镜及相差显微镜记录胃癌细胞粘附情况,结果显示,exosomes处理组对比PBS处理组腹膜间皮单层的粘附能力明显增强。上述结果表明,胃癌来源exosomes很可能通过诱导腹膜间皮细胞FN沉积而促进腹膜粘附。 6、ERK/AKT/STAT3通路参与胃癌exosomes诱导的腹膜间皮细胞FN合成 MGC803细胞分泌的exosomes处理HMrSV5细胞不同时间点(0、15min、30min、1h、3h、6h、12h),结果示,ERK及AKT通路呈持续性活化,而STAT3通路则呈一过性活化。给予ERK抑制剂PD98059(25μM),AKT抑制剂LY294002(20μM)及STAT3抑制剂Stattic(2μM)预处理2小时,免疫印迹实验证实胃癌exosomes诱导的FN上调均被明显抑制。这些结果提示,ERK/AKT/STAT3通路是胃癌exosomes诱导腹膜间皮细胞FN合成的重要信号通路。 结论: 1、胃癌exosomes通过破坏间皮屏障,诱导腹膜纤维化而促进腹膜转移。 2、胃癌exosomes通过凋亡和MMT机制促进腹膜间皮细胞损伤。 3、胃癌exosomes通过诱导FN沉积而促进腹膜粘附。