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雌激素通过雌激素受体(ERs)信号通路在机体生殖、内分泌、神经等许多系统中发挥着重要的生理作用,雌激素受体不仅对雌性生殖系统必不可少,对维持雄性生殖系统功能也具有重要作用。在神经系统,雌激素与受体结合后可以从多个水平影响痛觉的调控和传递。环境雌激素(双酚A)能够以内源性雌激素类似的形式和雌激素受体结合,从而影响细胞信号传导途径或模仿及干扰内源性雌激素作用,产生相应的生理病理效应。雌激素受体基因敲除(ERKO)小鼠的发明制备为研究ERs的功能提供了良好的实验动物模型,本研究在引进ERKO (aERKO和βERKO)小鼠并成功稳定繁殖后,应用ERKO小鼠研究双酚A (BPA)对雄性生殖系统的毒性作用及ERα和ERβ作用特点；探讨雌激素通过ERs对痛觉的影响及电压门控性钠离子通道的参与机制,并观察BPA对神经细胞电压门控性钠离子通道的影响。为研究ERs在雄性生殖系统和神经系统中的功能提供理论依据,同时从新的角度寻找BPA的毒作用靶标、探索BPA毒作用机理。第一部分ERKO小鼠的繁育及子代小鼠基因型的鉴定采用ERKO小鼠来研究ERs的功能及相关疾病,较其它研究方法能排除内源性基因的干扰,而且实验结果直观,可靠。我们研究室从美国Jackson实验室引进雌激素受体基因敲除小鼠的杂合体(ERα+/-、ERβ+/-),并成功稳定繁殖,经杂合体间的交配,获得纯合体(ERα-/-、ERβ-/-),采用PCR法对它们进行基因型鉴定。ERKO小鼠的获得,为探讨雌激素受体(ERα和Eβ)在环境雌激素(BPA)生殖毒性和雌激素对痛觉的影响过程中的功能提供了良好的实验动物模型。第二部分ERs介导环境雌激素(双酚A)影响ERKO小鼠雄性生殖许多研究证实,具有拟雌激素样活性的环境内分泌干扰物——双酚A(BPA)对雄性生殖系统有毒性作用,在本部分研究中,通过整体动物实验发现BPA(100 μg/kg/day,灌胃染毒30天)能够影响雄性小鼠生殖系统,使附睾脏器系数降低,精子畸形率升高,睾丸组织形态学观察,发现有病理变化。当BPA作用于aERKO和PERKO小鼠后,附睾脏器系数也降低,精子畸形率也升高,睾丸组织形态学也出现病变。荧光定量PCR实验发现BPA影响小鼠睾丸、附睾和前列腺中ERa和ERP mRNA的表达,BPA还能够通过依赖ERs影响钙离子通道(Cav3、RyRs和IP3Rs) mRNA的表达,提示BPA能够通过ERa和ERβ介导机制对雄性生殖系统产生毒性作用,这为BPA等环境雌激素毒性机制提供了依据。第三部分ERs介导环境雌激素(双酚A)和雌激素影响ERKO小鼠痛觉及机制研究大量动物实验及临床研究资料证实雌激素及其受体(ERa和ERβ)参与疼痛的调控和传递。本实验将小鼠卵巢切除后给予外源性雌激素,发现17β-E2对甩尾痛阈和缩足痛阈没有影响,敲除ERa或ERβ后甩尾痛阈和缩足痛阈也没有变化。但是17β-E2能够降低福尔马林炎症性痛实验的Ⅱ相反应,但对Ⅰ相反应无影响。提示雌激素可以影响慢性炎性痛,可能与影响急性痛进程无关。与WT小鼠比较,βERKO雌性小鼠在福尔马林炎症性痛模型Ⅱ相的疼痛反应行为的时间减少,Ⅰ相反应没有差别。aERKO小鼠福尔马林炎症性痛实验与WT比较没有区别。提示ERβ亚型在雌激素调节痛觉传递和调制过程中发挥着重要作用。人类痛觉的产生是由于外界有害性刺激引起伤害感受器的初级传入神经末梢兴奋,细胞膜去极化,形成向中枢神经系统传递的动作电位(Action Potential, AP)是由位于特定伤害性感受器的特定分子和离子通道激活的结果,而电压门控性钠离子通道的活化是神经元AP产生和传播的主要基础,在痛觉的发生、传递过程中发挥着重要作用。应用全细胞膜片钳电流钳实验发现,17β-E2抑制小鼠背根神经节(DRG)神经元AP的发放,AP的幅值减小,半封时程增加,提示雌激素可能会降低神经元的兴奋性。用全细胞膜片钳电压钳实验发现,17β-E2能够浓度依赖性的抑制小鼠DRG神经元TTX-S INa和TTX-R INa,提示雌激素可以通过影响电压门控性钠离子通道来影响神经元的动作电位,进而影响痛觉传递和调制。但是17α-E2对TTX-S INa和TTX-R INa钠电流没有影响。还观察了非透膜性大分子物质雌二醇-牛血清白蛋白结合物(E2-BSA)对TTX-S和TTX-R钠电流的抑制作用,推测雌激素对钠通道的作用可能是通过非基因组作用途径,由细胞膜上的ERs介导的。PKC特异性拮抗剂GO-6983和PKA特异性拮抗剂H-89能够阻断17β-E2对TTX-S INα和TTX-R INα的抑制作用,提示PKC和PKA信号通路可能参与17β-E2对钠离子通道的影响。ERs非特异性拮抗剂ICI182780能部分阻断17β-E2对TTX-S和TTX-R钠通道电流的抑制作用,ERa特异性激动剂——PPT和ERβ特异性激动剂——DPN都能够抑制TTX-S和TTX-R钠电流,提示ERa和ERβ可能均参与了雌激素作用钠离子通道的过程。应用ERKO小鼠发现,当敲除ERα或ERβ时,小鼠DRG神经元TTX-S和TTX-R钠电流均没有明显的变化。进一步,观察了17β-E2对ERKO小鼠DRG神经元TTX-S INα和TTX-R INα的影响,发现与WT小鼠比较,17β-E2对aERKO和BERKO小鼠TTX-S Nα抑制率减小,提示ERa和ERβ均参与了17β-E2对TTX-S钠通道的作用。与WT小鼠比较,17β-E2对βERKO小鼠TTX-R INα抑制率减小,aERKO小鼠区别不大。提示ERβ可能更多的参与了17β-E2对TTX-R钠通道的作用。17β-E2对钠通道电流动力学特性有影响,提示其对动作电位的产生和发放具有潜在的作用。这也为进一步探讨雌激素对钠通道的作用机制以及雌激素与疼痛的关系提供了依据。最后,应用全细胞膜片钳技术发现双酚A能够模拟17β-E2对钠通道的作用,通过PKA和PKC信号通路影响小鼠DRG神经元TTX-S INα和TTX-RINα,并影响其电流动力学特征。这些结果提示电压门控性钠离子通道是BPA的毒作用靶点之一,这可能会影响神经元兴奋性的发生和传递,最终导致痛觉等信息的改变。