研究背景:众多基础与临床试验已证实:骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）同种异体移植能改善心肌梗死患者的心功能,但BMSCs移植后的低存活率严重影响其长期疗效,限制了临床应用。BMSCs在受体内的存活是其维持疗效的基础,而提高BMSCs抗缺血缺氧能力,首先要了解其移植后发生的蛋白水平变化,探索影响其存活的重要因子。然而,从BMSCs移植区域中特异性提取其合成的蛋白质有一定困难,也难以区分是移植前还是移植后合成的蛋白质。利用甲硫酰基-tRNA合成酶基因（MetRS）突变的新生蛋白标记技术可以排除细胞本身固有蛋白及其它细胞合成蛋白的干扰并解决上述问题,定量分析BMSCs在移植至缺血心脏组织后新合成蛋白质谱的动态改变。目的:首先应用MetRS突变新生蛋白标记技术,探索BMSCs移植后在蛋白水平上发生的功能与代谢上变化,寻找可以改善BMSCs移植后存活及移植疗效的关键因子。经上述探索发现,凋亡诱导因子（AIF）可能是最关键的因子之一。随后将AIF敲减的BMSCs置于缺血缺氧环境中及移植至梗死心肌中,进一步证实AIF在BMSCs移植后存活及进一步恢复梗死后心功能中的重要性。方法:通过慢病毒感染的方法使BMSCs的MetRS基因第274位进行点突变,实现BMSCs新生蛋白的叠氮左亮氨酸（Anl）标记,并通过运用生物正交非典型氨基酸标记（BONCAT）及荧光非典型氨基酸标记（FUNCAT）技术验证该技术对BMSCs新生蛋白标记的能力。然后通过点击蛋白富集（Click-iT Protein Enrichment）技术及质谱分析（LC/MS）,特异性地在心梗组织中标记并提取缺血缺氧培养及移植至梗死心脏后新合成的蛋白,排除其它细胞合成蛋白的干扰,揭示出BMSCs内部蛋白水平上发生的变化,并通过生信分析得出AIF是影响其存活的关键因子之一。最后,将下调AIF表达的BMSCs置于缺血缺氧环境中培养,证实其影响存活的重要性;再将其移植至小鼠梗死心脏中,观察其对梗死心脏的治疗效果及心功能恢复情况。结果:1、通过基因克隆及慢病毒感染,成功构建MetRSL274G-BMSCs细胞系,并通过FUNCAT、BONCAT试验证明MetRS突变新生蛋白标记技术可用于BMSCs新生蛋白的特异性标记。2、成功构建BMSCs体外缺血缺氧培养模型,分析BMSCs置于缺血缺氧环境中培养后的新生蛋白质谱变化:对照组和缺血缺氧组的BMSCs新生蛋白种类分别共有1326种和1323种,两组共有蛋白有1219种,占比约为92%。差异蛋白（1.5倍以上的变化且p＜0.05）有79种,最大部分位于细胞核,其次为线粒体,均与BMSCs在缺血缺氧环境中死亡密切相关。3、体外实验蛋白质谱分析提示:细胞凋亡相关蛋白和actin细胞骨架调控相关蛋白的调控与BMSCs在缺血缺氧培养状态下的死亡密切相关。其中,线粒体中的AIF-m表达较正常培养组下降了 6.17倍（p＜0.05）,胞核中的具有致凋亡作用的可溶性AIF-c则明显增高（p＜0.05）,提示AIF被剪切进入细胞核并发挥促凋亡作用。4、将MetRS基因突变的BMSCs分别注射进入正常心脏及梗死心脏中,分别于术后第1、3、7天提取新生蛋白,鉴定出6组心脏组织的新生蛋白种类在713-863之间,有648种蛋白为6组共同存在,占比约为77～87%,差异蛋白（1.5倍以上的变化且p＜0.05）分别有37、138和84种。5、体内实验蛋白质谱分析提示:BMSCs移植至梗死心脏后,新合成的蛋白在细胞外基质组织、外泌体分泌和对应激反应的调节更为明显,并能通过改变补体和凝血级联、调节肌动蛋白细胞骨架和细胞凋亡来应对受体体内的缺血/缺氧环境。6、与细胞凋亡相关的蛋白组织蛋白酶B（Cathepsin B,CATB）、重组核纤层蛋白前体A/C（Prelamin-A/C,LMNA）及AIF-M1,不仅表达量在移植前后变化大,而且与其它的差异蛋白也存在相互作用关系,参与多条通路的调控,可能是造成BMSCs移植后死亡的最重要因子。其中,AIF最为重要:在BMSCs在移植治疗心梗小鼠体内的心梗边缘区后,其线粒体中的AIF-m表达显著降低,在第1天及第7天分别下降了 1.57及3.52倍（p＜0.05）。7、通过慢病毒感染成功构建AIF表达下调的BMSCs（感染效率为97.5%）。感染后的BMSCs与正常BMSCs 比较,AIF表达下降了 59.93%（P＜0.01）。将AIF基因敲减的BMSCs在体外缺血清缺氧培养12小时后,与正常BMSCs 比较,AIF 表达降低 23.83%（P＜0.01）,BMSCs 凋亡率减少了 52.20%（P＜0.05）,细胞活力增加11.30%（P＜0.05）。8、将AIF基因敲减的BMSCs移植至梗死组织中,与移植正常BMSCs相比,BMSCs移植后在受体内的细胞存活量增加了 2.84倍（P＜0.01）,心梗小鼠BNP水平下降了 17.8%（P＜0.01）,心梗4周后EF值绝对值增加了 3.13%,并且显著减少了梗死区域AIF蛋白表达（免疫荧光）、心肌纤维化程度（Masson染色）与梗死范围（TTC染色）。结论:1.运用MetRS突变的新生蛋白标记及富集技术能有效地提取BMSCs在缺血缺氧培养环境下及移植至梗死心脏后的新生蛋白,并能从蛋白水平反映了BMSCs细胞本身的功能及代谢变化。2.BMSCs在体外置入缺血清缺氧培养的环境后,细胞凋亡、能量代谢及肌动蛋白细胞骨架调节在BMSCs应对缺血环境、维持细胞存活中起到了重要作用。3.BMSCs移植至梗死心脏后,新合成的蛋白参与细胞外基质组织、外泌体分泌、对应激的反应和凋亡过程的调节更为明显,并能通过调节肌动蛋白细胞骨架来应对受体体内的缺血缺氧环境,补体激活及细胞凋亡的调节影响着BMSCs移植后的存活。4.慢病毒感染敲减AIF表达可减少BMSCs移植后凋亡,增加BMSCs在供体内的存活;移植AIF敲减的BMSCS能减少心梗后心肌纤维化,改善心功能;结合BMSCs在体外置入缺血清缺氧培养的环境后及移植至梗死心脏后的新生蛋白质谱分析,证实AIF是调节BMSCs移植后存活、提高BMSCs移植疗效的关键因子之一。