番木瓜(Carica papaya L.)是典型的呼吸跃变型果实,含有丰富的营养物质,如类胡萝卜素。类胡萝卜素是一种对人体健康非常重要的营养物质,然而,人和动物却不能合成类胡萝卜素,只能通过饮食从食物中摄取。番木瓜鲜果中的类胡萝卜素与果实营养品质密切相关。番木瓜按照果肉颜色可以分为红肉和黄肉两种,红肉番木瓜富含番茄红素,而黄肉番木瓜富含β-胡萝卜素和β-隐黄质。在番木瓜果实后熟衰老过程中,红肉番木瓜果实中积累的类胡萝卜素总量较黄肉番木瓜多。类胡萝卜素合成通路基因对植物类胡萝卜素积累有着重要的作用,如PSY、PDS、ZDS、LCY-e、LCY-b、CHY-b等。因此,研究番木瓜果实后熟过程中的类胡萝卜素代谢调控机制,对于提高番木瓜果实品质具有重要的理论指导意义。NAC是一类植物所特有的转录因子,在植物的生长发育、抗逆反应和激素信号响应中都发挥着重要作用。有研究表明,NAC类转录因子参与调控番茄果实类胡萝卜素的积累。但是,NAC类转录因子是否参与以及怎样调控番木瓜果实后熟过程中的类胡萝卜素代谢尚不清楚。为此,我们以两个番木瓜品种‘Suiyou-2’和‘Suihuang’为研究对象,深入研究了NAC类转录因子参与番木瓜果实后熟过程中的类胡萝卜素代谢的调控机制。主要研究结果如下:1.分析比较了‘Suiyou-2’和‘Suihuang’番木瓜果实成熟衰老表达谱,共鉴定出7111个差异表达基因,其中响应果实成熟衰老的基因较多,两个品种间的差异表达基因相对较少。被注释的番木瓜差异表达基因主要可分为36类,涉及分子功能、生物学过程和细胞组分三大类。在差异表达的转录因子中数量最多的是bHLH,其次是WRKY、MYB、NAC、ERF。共鉴定到11个差异表达的类胡萝卜素代谢基因,荧光定量PCR(qRT-PCR)的结果显示这11个基因在番木瓜果实后熟过程中的表达变化趋势与表达谱数据相一致。2.CpNAC1通过激活CpPDS2/4、CpZDS、CpLCY-e和CpCHY-b的表达来参与番木瓜果实后熟过程中的类胡萝卜素代谢。qRT-PCR分析发现,CpNAC1在果实的后熟过程中表达趋势上调,CpPDS2/4、CpZDS、CpLCY-e和CpCHY-b的转录表达也受果实成熟衰老的诱导,与果实后熟过程中类胡萝卜素总量的积累相一致。更为重要的是,通过凝胶阻滞迁移实验(EMSA)发现CpNAC1可以直接结合CpPDS2/4、CpZDS、CpLCY-e和CpCHY-b的启动子;双荧光素酶报告系统实验(DLR)显示,CpNAC1具有转录激活活性,并且可以激活CpPDS2/4、CpZDS、CpLCY-e和CpCHY-b启动子的活性。这些结果说明CpNAC1作为转录激活子,可以通过对类胡萝卜素合成相关基因CpPDS2/4、CpZDS、CpLCY-e和CpCHY-b的激活作用来调控番木瓜果实后熟过程中的类胡萝卜素代谢。3.CpNAC2和CpEIN3a调控CpPDS2/4、CpLCY-e和CpCHY-b的表达,参与番木瓜果实后熟过程中的类胡萝卜素代谢。qRT-PCR分析发现CpNAC2和CpEIN3a在果实的后熟过程中表达上调。EMSA结果显示,CpNAC2可以直接结合CpPDS2/4、CpZDS、CpLCY-e和CpCHY-b的启动子,而CpEIN3a能够直接结合CpPDS4和CpCHY-b的启动子。酵母双杂交(Y2H)和双分子荧光互补实验(BiFC)的结果共同说明,CpNAC2和CpEIN3a之间存在蛋白相互作用关系。DLR实验表明,CpNAC2和CpEIN3a都具有转录激活活性,且CpNAC2能够激活CpPDS2/4、CpLCY-e和CpCHY-b的启动子活性,而CpEIN3a能够激活CpPDS4、CpLCY-e和CpCHY-b的启动子活性。更有趣的是,当共转CpNAC2和CpEIN3a时,对报告基因CpPDS2和CpLCY-e的激活能力明显增强。这些结果说明CpNAC2和CpEIN3a相互作用,单独或者协同激活类胡萝卜素合成相关基因CpPDS2/4、CpZDS、CpLCY-e和CpCHY-b的表达,共同参与番木瓜果实后熟过程中的类胡萝卜素合成。