背景：结肠癌是全世界最为显著的健康杀手之一，尽管最近这种癌症在几个西方国家内通过提高意识、早期检查及有效的预防措施下发病率有所降低，每年仍有超过120万的新患病例，并且有超过60万人死于结肠癌。现在，早期的结肠癌患者通过外科手术进行治疗，而分期较晚的患者则通过化疗结合外科手术治疗。然而，大多数患者会最终发展成转移性疾病并死于这种癌症，因此，能够早期诊断、治疗及抑制肿瘤进展并有效的控制这种疾病的新方法仍需进一步探索。MicroRNA（miRNA）是一组天然存在的非编码小分子RNA，长21-25个核苷酸，它通过特异性抑制或降解靶mRNA的翻译，调节靶基因的表达。越来越多的证据表明，MicroRNA在调节多种在人体内的生理和病理过程，如细胞分化，新陈代谢和肿瘤的发生中发挥关键作用。在人类癌症中，miRNA的功能可根据靶基因的不同作为调控肿瘤发生发展的癌基因或抑癌基因。因此，应用像TargetScan一样的计算机软件根据特定的算法进行分析和预测miRNA的靶基因，能够揭示MicroRNA在大肠癌发展过程中的调控机制。由于MicroRNA在基因调控过程中所能表现出的高效、节能、迅速、可逆等特点，让我们对它充满期望。众所周知，肿瘤的形成是一个复杂而又神秘的过程，虽然随着研究的深入，人们逐渐掌握了一些信号通路和作用位点，但很难通过对单一位点或通路进行阻断而取得满意的效果。MicroRNA显然给予了我们另一个可以选择的方向，它能够同时作用于多个基因靶点，同时序列保守，易于获取。它在生物生理和病理过程中所起到的作用，它在诊断与治疗当中所带来的效果都很让人难忘。最近的研究表明，miRNA22能够调控并作为多种肿瘤的抑癌基因。此外，它的表达的改变与大肠癌的预后不良有关。随后，我们选择Tiam1、VEGF、MMP2及MMP9一方面是通过软件进行靶基因预测，另一方面，要从这几个已经由研究证明与结肠癌细胞的发生、发展有确切关系的位点，分别从结肠肿瘤的细胞骨架的形态改变、新生血管形成、明胶酶的生成这几个不同的角度去观察MicroRNA22在结肠肿瘤中直接或间接所表现出的调控作用。另外，虽然最近已经有人指出mir-22在大肠癌细胞缺氧状态时能够抑制HIF-1a翻译发挥其抑癌作用，mir-22在有氧状态下对于结肠癌细胞的调控机制和作用靶点到现在为止仍是一片空白。目的：明确高表达MicroRNA22对于结肠癌细胞HCT116在增殖、侵袭和迁移能力的影响。验证有氧状态下mir-22对于结肠癌细胞发挥调控作用的靶细胞，明确mir-22对于Tiam1、VEGF、MMP2和MMP9的调控能力。方法：人类结肠癌细胞系HCT-116购自中科院组织标本库。由miRBase下载人类MicroRNA22基因序列（hsa-miR-22序列5-AGUUCUUCAGUGGCAAGCUUUA-3）后送invitrogen合成目的基因，进行MicroRNA22高表达载体构建。目的质粒名称SD13-hsa-mir-22。构建成功后应用Chromas进行基因测序，证实高表达载体建立成功。按照质粒提取试剂盒的步骤完成质粒提取，取对数生长期细胞，以4×104个细胞/孔的密度铺于24孔板培养，当细胞生长到70%进行转染，将铺板细胞分为三组，第一组为转染miRNA-22组，第二组为空质粒转染组（NC组），第三组为空白对照组（不加转染试剂）。转染48小时后检测荧光素酶活性(奥林巴斯荧光显微镜SZ61GFP/T-S)，确定转染效率达到85%，每组实验重复3次。应用Takara公司生产的试剂盒进行提取miRNA并进行反转录，配制PCR反应液，应用分光光度计测定cDNA浓度，将加样前的cDNA浓度均进行相当倍数的稀释，使其浓度统一，使20μl反应液中使用相当于100ng Total DNA量的cDNA为模板。microRNA22及U6引物由广州锐博公司设计及合成。设置反应条件后进行RealtimePCR反应，反应结束后应用7300System SDS Software进行数据分析，确认标准曲线及溶解曲线。比较转染miRNA-22组、转染空质粒NC组和未经处理对照组细胞组的miRNA-22表达量。确认高表达模型构建成功。应用MTT法检测3组细胞生长速度。应用铺设Matrigel胶和未铺设Matrigel胶的transwell小室分别检验mir-22组、NC组、及空白对照组细胞的侵袭和迁移能力。利用MicroRNA数据库（http://www.sanger.ac.uk／Software/Rfam／mirna／)和TargetScan软件(http://www.targetscan.org/)预测MicroRNA-22调控的靶基因。设计Tiam1、VEGF、MMP2及MMP9的引物，应用RealtimePCR检测三组细胞的Tiam1、VEGF、MMP2及MMP9变化。应用免疫细胞化学染色法检测Tiam1、VEGF、MMP2及MMP9在三组细胞中的表达变化。然后分别从高表达mir-22组、NC转染组及HCT-116空白对照组中分别加入细胞裂解液（Takara,Japan），并按照步骤提取蛋白，进行Western blot反应后，将胶片进行扫描，用凝胶图像处理系统分析。结果：定量PCR结果显示，HCT-116细胞的miRNA-22的表达量较低，转染miRNA-22组细胞的miRNA-22表达量分别是转染空质粒NC组和未经处理对照组细胞的17.60±0.93倍和17.65±0.98倍。证实高表达miRNA-22细胞模型建立成功。MTT检测细胞生长证实了高表达miRNA-22对结肠癌细胞HCT-116细胞的生长速度的影响:转染细胞用MTT法绘制细胞生长曲线。可见转染高表达mir-22的HCT116细胞和转染空载体的细胞及未转染的阴性对照组细胞相比，生长速度明显减慢。而转染空载体组及阴性对照组细胞生长速度无明显差距。迁移实验结果回报：miRNA-22转染48小时后采取Transwell迁移实验测MIR-22组、NC组及未转染细胞组HCT-116细胞的迁移能力，400倍光学显微镜下计数每个视野内穿透小室微孔膜的细胞数，计算平均数。结果显示：miR-22转染组细胞穿膜数（59±3.75）显著低于NC转染组（81±4.65）及空白对照组（78±3.97）HCT-116细胞穿膜数。高表达miR-22后及穿透微孔滤膜的细胞数较阴性对照组和空白对照组降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。表明miR-22能明显降低HCT-116的迁移能力。侵袭实验结果回报：miRNA-22转染48小时后采取Transwell侵袭实验测MIR-22组、NC组及未转染细胞组HCT-116细胞的侵袭能力，400倍光学显微镜下计数每个视野内穿透Matrigel聚合胶及和小室微孔膜的细胞数，计算平均数。结果显示：miR-22转染组细胞穿膜数（29±1.75）显著低于NC转染组（38±2.32）及空白对照组（42±2.65）HCT-116细胞穿膜数。施加外源性miR-22后穿透Matrigel和微孔滤膜的细胞数较阴性对照组和空白对照组降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。表明miR-22能明显降低HCT-116的侵袭能力。real time PCR检测MMP2、MMP9、VEGF及TIAM1表达。获取各组细胞的CT值后，采取ΔΔCt法进行数据整理。得知HCT116细胞转染miRNA-22后，与转染空质粒的NC组细胞及未经处理的HCT116细胞相比，MMP2、MMP9、VEGF及TIAM1表达明显降低，其NC组细胞及未经处理的HCT116细胞的MMP2、MMP9、 VEGF及TIAM1对转染miRNA-22细胞组的相对倍数： MMP217.27±0.64，17.74±2.53；MMP915.76±0.85，16.04±0.23；VEGF12.14±0.61，11.78±0.82；TIAM18.05±0.64，9.077±0.25。而作为内参照的U6和β-actin的数值在三组当中都非常稳定。免疫细胞化学检测mmp2、mmp9、VEGF和tiam1的表达分别以高表达microRNA-22组、空质粒转染组（NC组）及未转染组（阴性对照组）进行对比分析。化学试剂一抗均为单克隆抗体，试剂选用mmp2、mmp9、VEGF及tiam1。根据不同的抗体，阳性结果分别在细胞核和/或细胞浆处染色，每张玻片选择10个高倍视野观察，着色定位准确，呈明显棕黄色或棕褐色颗粒为阳性细胞数，阳性细胞数>10%为标志物阳性表达，阳性细胞数<10%为阴性表达。结果显示：高表达microRNA-22组细胞与NC组和阴性对照组细胞相比，mmp2、mmp9、VEGF及tiam1均呈现弱表达，而两对照组呈显著阳性表达,差异显著。W通过灰度分析软件分析Western blot结果证实，mir-22的表达水平对于mmp2、mmp9、VEGF、Tiam1的蛋白表达水平具有调控作用。高表达mir-22组与空载体转染细胞、未转染细胞比较，上述蛋白表达水平显著降低，其差异具有统计学意义（P<0.01）。结论：可成功构建microRNA22高表达质粒，转染大肠癌细胞HCT-116细胞系，构建高表达microRNA22的HCT-116细胞模型。转染高表达mir-22的大肠癌HCT116细胞生长速度明显减慢。高表达mir-22的HCT116细胞的迁移和侵袭能力显著降低。在有氧状态下microRNA22仍可以对大肠癌细胞进行调控，发挥其抑癌作用。Tiam1是mir-22在大肠癌细胞上的作用靶点。mir-22通过抑制Tiam1的表达发挥其抑癌作用。在大肠癌细胞HCT116中mir-22能够调控VEGF，抑制其表达，从而抑制大肠肿瘤组织新生血管生成。在大肠癌细胞HCT116中mir-22能够调控mmp2及mmp9，抑制其表达，从而抑制大肠肿瘤细胞的侵袭和迁移。本研究的创新点：本文首次验证了tiam1可以在大肠癌细胞中作为mir-22的靶点。近期有研究证明了mir-22在大肠癌细胞缺氧状态时能够抑制HIF-1a翻译发挥其抑癌作用，本研究证实在有氧状态下mir-22也能抑制大肠癌细胞的增殖、侵袭及迁移，并通过调控tiam1、VEGF、mmp2和mmp9发挥其抑癌作用。同时，我们通过高表达mir-22在大肠肿瘤细胞中所发挥的作用也揭示了应用mir-22进行基因治疗的可行性。