论文部分内容阅读
茯砖茶（Fu brick tea,FBT）,作为一种以黑毛茶为原材料生产而成的黑茶,具有降血糖、抗炎、抗癌、减脂等多种生理功效。在FBT的生产过程中,黑毛茶中的茶多酚在以冠突散囊菌（Eurotium cristatum）为主的复合菌种的作用下氧化聚合,并结合多糖、蛋白质等物质形成稳定性较高的茶褐素。由于茶褐素作为一种大分子量化合物,其结构比较复杂,因此关于茶褐素生理功效及消化过程中物质代谢的研究相对较少。另外,在茶叶工业化生产中,水提物的浸提会产生大量茶渣,而茶渣的弃用不仅会造成资源的浪费,也会引发环境的污染。本研究首次通过体外模拟消化的方法,探究了茯砖茶茶褐素（Fu brick tea theabrownin,FBTB）在胃、小肠及肠道菌群作用下的物质代谢变化。之后通过构建体内慢性溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis,UC）模型,并结合16S r RNA基因测序、代谢组学、“伪无菌”小鼠模型构建、粪菌移植（Fecal microbiota transplantation,FMT）等方式,首次研究了FBTB的抗炎活性及其基于肠道菌群代谢的抗炎机制,并进一步探究了FBT水提后茶渣中茯砖茶结合态多酚（Fu brick tea bound polyphenol,FBTBP）的抗炎活性及其机制。主要研究内容和结果如下:（1）本研究采用水提法从FBT中提取FBTB,并通过有机试剂萃取、乙醇沉淀和透析法进行纯化。通过测定FBTB的化学组成并观察其结构,本研究证明了所提取的FBTB的纯度为69.98±0.82%,它是一种富含羟基和羧基的,以酚类物质、糖类物质和蛋白质为主要成分的球状聚合物。此外,通过测定FBTB在胃、小肠和肠道菌群消化过程中的物质代谢变化,本研究证明了FBTB中的氨基酸类物质和小分子糖类物质主要在胃和小肠的消化过程中被释放,而酚酸类物质主要在胃部的消化过程中被释放。在此过程中,FBTB可以产生咖啡酸、芦丁和6-磷酸海藻糖等具有抗炎活性的小分子物质,这可能使FBTB具有良好的抗炎活性。此外,FBTB可以显著促进丙酸的产生,丙酸极有可能是介导FBTB调节脂质代谢和降低血糖等体内效应的关键肠菌群代谢物。（2）以雄性C57BL/6小鼠为载体,本研究使用葡聚糖硫酸钠（Dextran sulfate sodium,DSS）构建慢性UC模型,并使用FBTB进行干预,以此研究FBTB对UC的缓解效果。实验结果表明给小鼠灌胃FBTB（400 mg/kg·bw）可以有效地减轻UC小鼠的临床症状,缓解由UC引起的脾重量增加、结肠长度缩短以及结肠组织的病理损伤,降低肠上皮细胞通透性并提高结肠抗氧化水平。此外,16S r RNA基因测序结果表明FBTB可以有效地缓解由UC引起的肠道菌群紊乱,提高UC小鼠体内乳杆菌（Lactobacillus）和副萨特氏菌（Parasutterella）等有益菌的相对丰度。同时,代谢组学分析表明了FBTB可以调节色氨酸代谢并提高肠道吲哚乙酸（Indole-3-Acetic acid,IAA）和吲哚乙醛（Indole-3-acetaldehyde,IAld）的含量,而IAA和IAld可以通过激活肠道固有层细胞的的芳香烃受体（Aromatic hydrocarbon receptors,Ah R）,诱导白细胞介素（Interleukin,IL）-22在小鼠结肠组织中的表达,并通过促进肠道紧密连接（Tight junction,TJ）蛋白ZO-1和Occludin的表达修复UC导致的肠屏障损伤。（3）为了探究肠道菌群及其代谢物是否在FBTB缓解UC中发挥关键作用,本研究使用广谱抗生素（Antibiotics,Abs）建立了“伪无菌”小鼠模型,并使用FBTB进行干预,发现Abs治疗的效果并没有FBTB的干预效果明显,并且FBTB良好的抗炎效果和对色氨酸代谢的调节作用在“伪无菌”小鼠体内无法实现,证明了FBTB对UC的缓解作用以及对色氨酸代谢的调节作用是依赖于肠道菌群的。为了再次确认肠道菌群以及代谢物的作用,本研究又进一步采集了干预实验中小鼠的肠道菌群,将其移植给对应的小鼠进行FMT实验。研究结果表明移植FBTB干预后小鼠的肠道菌群可以恢复FBTB对色氨酸代谢的调节作用。另外,FMT可以大幅度提高UC小鼠体内乳杆菌（Lactobacillus）的相对丰度,表明FBTB是通过调节肠道菌群结构,并提高乳杆菌（Lactobacillus）的相对丰度改善UC并调节色氨酸代谢的。（4）为了避免FBT水提后茶渣中资源的浪费,本研究进一步通过体外粪菌发酵实验探究了FBT水提残渣中FBTBP的释放动力学特征,并在体内进一步研究了FBTBP的结肠靶向释放及其抗炎活性机制。研究结果表明FBTBP的主要成分为对羟基苯甲酸和槲皮素,其可以在肠道菌群代谢的作用下在0-6 h内释放,并被逐步分解代谢。另外,FBTBP还可以促进多糖代谢形成SCFAs,有效缓解UC引起的腹泻和便血等临床症状,修复结肠组织损伤,并减轻UC小鼠体内的免疫应激和氧化应激,其调节糖代谢的机制可能与促进亚油酸代谢和增加杜氏杆菌（Dubosiella）和肠杆菌（Enterorhabdus）等益生菌的相对丰度有关。综上所述,本研究首次证明了FBTB作为多酚氧化聚合后的产物,在消化过程中可以产生咖啡酸等具有抗炎活性的小分子化合物。此外,FBTB可以通过改变肠道菌群结构,并促进乳杆菌（Lactobacillus）的增殖的方式调节色氨酸代谢、促进IL-22的产生并修复由UC引起的肠道屏障损伤,进而缓解UC。另外,本研究还发现FBT水提后残渣中的FBTBP可以通过促进多糖的代谢发挥良好的抗炎作用,其机制可能与益生菌相对丰度的增加和促进亚油酸代谢有关。本研究为FBT中生物活性物质的开发利用提供了理论基础。