目 的：本研究以中医理论“肾主骨”为依据,从成骨分化的BMP2-Smad-Runx2信号途径出发,采用细胞培养、Elisa检测、免疫荧光细胞染色法、Western blot和RT-PCR等多种技术方法,观察补肾中药肉苁蓉(传统补肾中药)中的活性成分松果菊苷含药血清诱导骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)向成骨细胞分化的作用,并从细胞及分子水平揭示松果菊苷含药血清发挥诱导作用的机制,为骨组织工程的种子细胞的来源提供一种新的诱导剂,为BMSCs在组织工程及骨折愈合及骨缺损修复方面的应用提供理论基础及相关依据,也为松果菊苷的进一步开发利用提供一个新的思路。材料与方法：第一部分：松果菊苷促进BMSCs增殖的研究。1.制备松果菊苷含药血清。取60只SPF级SD大鼠,采用随机数字表法分为正常组和松果菊苷(Echinacoside,ECH)组。松果菊苷组给予松果菊苷水溶液(松果菊苷的浓度为4mg/ml,每只大鼠每次灌胃lml)灌胃,正常对照组给予等体积的生理盐水,两组每日均灌胃2次,连续4d。末次灌胃后用10%水合氯醛进行腹腔麻醉,用负压采血管从腹主动脉采血,室温下使血液自然凝固,离心后分离出血清,经56℃水浴灭活30min,过滤除菌后分装到无菌的离心管中,-80℃冰箱保存。2. BMSCs的分离培养。采用全骨髓贴壁筛选方法进行原代BMSCs的分离,在37℃,含5%CO2的饱和湿度培养箱中培养。接种后第3d在倒置显微镜下观察,见细胞贴壁后半量换液,以后每2d换液1次。原代培养14d时细胞融合达80%,进行传代培养。3. BMSCs的鉴定。取对数生长期的P3代BMSCs,接种在置有盖玻片的24孔培养板内,培养箱中培养,每天更换培养基,培养4d。免疫荧光检测CD29、CD34、CD44的表达。4.松果菊苷对BMSCs增殖的影响。取对数生长期的P3代BMSCs,调整细胞浓度为3×104/ml,接种于7块96孔培养板,培养板边缘孔用无菌PBS填充,其余每孔加入100 u 1细胞悬液,置培养箱中培养。接种后第2d,按照实验分组,正常对照组、阳性对照组、不同浓度松果菊苷含药血清组(2.5%、5%、7.5%、10%、15%、20%含药血清)更换相应的培养基,每组设6个复孔,每日上午相同时间更换培养基,共培养7d。每天取1块培养板,每孔加入20μL MTT溶液(5mg/ml)培养4h后吸去培养基,每孔加入DMSO低速震荡l0min,检测各孔490nm的吸光度。第二部分：松果菊苷诱导BMSCs成骨分化的研究。1.松果菊苷诱导BMSCs成骨分化时,碱性磷酸酶染色检测。取对数生长期的P3代BMSCs,接种在置有盖玻片的24孔培养板内,置于37℃,5%CO2培养箱中培养,第2d按实验分组(同第一部分)更换不同培养基,每组设3个复孔。每2d更换培养基,连续培养7d,用4%多聚甲醛固定30min,并加入新鲜配置的底物应用液,37℃下避光孵育,15min后蒸馏水冲洗,镜下观察。2.松果菊苷诱导BMSCs成骨分化时,碱性磷酸酶含量检测。取对数生长期的P3代BMSCs,调整细胞浓度为3×104/mL,接种于24孔培养板,第2d按实验分组(同第一部分)更换不同培养基,每组设3个复孔。每2d换培养基,连续培养7d。第8d弃去培养基用PBS洗细胞2次,每孔加入细胞裂解液(RIPA)50μl,使细胞充分裂解。将样本转移到EP管中,超声粉碎,3000rpm离心20min,收集上清于-20℃保存备用。按ELISA试剂盒说明操作,测定各样本ALP含量。3.松果菊苷诱导BMSCs成骨分化时,骨钙素的免疫荧光细胞染色检测。取对数生长期的P3代BMSCs,接种在置有盖玻片的24孔培养板内,第2d按实验分组(同第一部分)更换不同培养基,每组设3个复孔,每2d更换培养基,培养14d。免疫荧光检测骨钙素表达。4.松果菊苷诱导BMSCs成骨分化时,骨钙素含量的检测。取对数生长期的P3代BMSCs,调整细胞浓度为3×104／mL,接种于24孔培养板,第2d按实验分组(同第一部分)更换不同培养基,每组设3个复孔。每2d换培养基,连续培养14d。第15d取细胞裂解液,按ELISA试剂盒说明操作,测定各样本BGP含量。5.松果菊苷诱导BMSCs成骨分化时,Ⅰ型胶原的免疫荧光细胞染色检测。取对数生长期的P3代BMSCs,接种在置有盖玻片的24孔培养板内,置于培养箱中培养,第2d按实验分组(同第一部分)更换不同培养基,每组设3个复孔,每2d更换培养基,培养7d。免疫荧光检测Ⅰ型胶原表达。6.松果菊苷诱导BMSCs成骨分化时,矿化结节检测。取对数生长期的P3代BMSCs,调整细胞浓度为3×10-/mL,接种于24孔培养板,CO,培养箱培养,第2d按实验分组(同第一部分)更换不同培养基,每组设3个复孔。每2d换培养基,连续培养21d。弃去培养基,4%多聚甲醛固定30 min,PBS冲洗3次,用0.1%茜素红S染色液(pH8.3)在37℃下染色30min,PBS冲洗数次,自然干燥,镜下观察。第三部分：松果菊苷诱导BMSCs成骨分化机制的研究。1.松果菊苷诱导BMSCs成骨分化时,BMP2表达的检测。取P3代BMSCs,接种在置有盖玻片的24孔培养板内,置于37℃5%C02培养箱中培养,第2d按实验分组(正常对照组、阳性对照组、松果菊苷组)更换不同培养基,每组设3个复孔,每2d更换培养基,培养7d。采用免疫荧光细胞染色、Western blot、RT-PCR检测BMP2表达。2.BMP2抑制剂Noggin对松果菊苷诱导BMSCs成骨分化时,碱性磷酸酶含量的影响。取对数生长期的P3代BMSCs,调整细胞浓度为3×104/mL,接种于24孔培养板,第2d按实验分组(正常对照组、阳性对照组、松果菊苷组、抑制剂Noggin组)更换不同培养基,每组设3个复孔。每2d换培养基,连续培养7d。第8d裂解细胞,收集样本于-20℃保存备用。按ELISA试剂盒说明操作,测定各样本ALP含量。3.BMP2抑制剂Noggin对松果菊苷诱导BMSCs成骨分化时Smadl/5/8、ZHX3、Runx2和OSX表达的影响。取P3代BMSCs,接种在置有盖玻片的24孔培养板内,置于37℃5%CO2培养箱中培养,第2d按实验分组(正常对照组、阳性对照组、松果菊苷组、抑制剂Noggin组)更换不同培养基,每组设3个复孔,每2d更换培养基。采用免疫荧光细胞染色、Western blot、RT-PCR检测Smad1/5/8、ZHX3、Runx2和OSXmRNA和蛋白表达变化。结果：1.全骨髓贴壁法分离培养BMSCs的形态特征观察。原代培养第1d,贴壁细胞较少,形状近似圆形。培养第2-3d出现长梭形贴壁细胞,数目逐渐增多,细胞形态逐渐变长。培养第5d可见贴壁的梭形细胞数量进一步增多,开始形成分散的小集落,呈菊花样生长。培养第10d细胞集落逐渐增多增大,集落中心的细胞密度较大,细胞体积相对较小,集落周边细胞分布稀疏,呈放射状分布,细胞集落大小不一,集落彼此出现融合。培养14d左右,细胞融合度接近80%,用胰酶消化后,传代培养,传代后的细胞形态逐渐均一,P3代BMSCs表现为成纤维细胞特征,呈梭形,融合后表现为极性、旋涡状生长。2.全骨髓贴壁法分离培养的细胞鉴定。免疫荧光细胞染色法检测细胞表面的CD29、CD34、CD44的表达,其中CD29和CD44表达为阳性,CD34不表达,表明用全骨髓贴壁法分离培养的细胞具有BMSCs特征。3.松果菊苷对BMSCs增殖的影响。用不同浓度松果菊苷含药血清培养BMSCs,进行MTT检测。同一时间点与正常对照组比较,2.5%松果菊苷含药血清没有促进BMSCs增殖的作用,差异无显著性(P>005),5%、7.5%、10%、15%松果菊苷含药血清能明显促进BMSCs细胞增殖,有显著性差异(P<0.05),其中15%松果菊苷含药血清的促增殖作用最强,有极显著性差异(P<0.01)。当给药浓度过高时,如20%松果菊苷含药血清组对BMSCs的增殖无促进作用。从促进细胞增殖的角度考虑5%、7.5%、10%、15%松果菊苷含药血清的效果较好。4.松果菊苷诱导BMSCs成骨分化过程中ALP的变化。按不同处理因素培养细胞7d后,ELISA检测细胞裂解上清液中ALP含量的变化,与正常对照组比较,阳性对照组及7.5%、10%、15%松果菊苷含药血清组的ALP表达明显升高,差异有显著性(P<0.05)。与阳性对照组相比,7.5%及10%松果菊苷含药血清组的ALP的表达明显增高,有极显著性差异(P<0.01)。ALP染色结果显示,正常对照组和2.5%松果菊苷含药血清组细胞内棕黄色颗粒较少,两组无显著性差异(P>0.05)；与正常对照组相比,阳性对照组与7.5%、10%、15%松果菊苷含药血清组细胞内棕黄色颗粒明显增加,有极显著性差异(P<0.01)； 10%松果菊苷含药血清组的ALP的表达与阳性对照组相比,有显著性差异(P<0.05)；而20%松果菊苷含药血清组ALP表达虽略有增高,但与阳性对照组比无显著性差异(P<005)。5.松果菊苷诱导BMSCs成骨分化过程中BGP的变化。按不同处理因素培养细胞14d后,ELISA检测细胞裂解上清液中BGP含量的变化,与正常对照组比较,阳性对照组及10%松果菊苷含药血清组的BGP表达明显升高,差异有显著性(P<-0.05)。与阳性对照组比较,10%松果菊苷含药血清组的BGP的表达增高,有显著性差异(P<0.05)。免疫荧光细胞染色检测结果显示,与正常对照组相比,阳性对照组与10%松果菊苷含药血清组细胞的BGP表达,有显著性差异(P<0.01)；10%松果菊苷含药血清组的BGP的表达与阳性对照组相比,有显著性差异(P<0.05)。6.松果菊苷诱导BMSCs成骨分化过程中Ⅰ型胶原的变化。按不同处理因素培养细胞7d后,免疫荧光细胞染色检测结果显示,与正常对照组相比,阳性对照组与10%松果菊苷含药血清组细胞的Ⅰ型胶原表达增多,有极显著性差异(P<0.01)；10%松果菊苷含药血清组的Ⅰ型胶原的表达与阳性对照组相比,有显著性差异(P<0,05)。7.松果菊苷诱导BMSCs成骨分化过程中矿化结节的检测。按不同处理因素培养细胞21d后,茜素红染色检测结果显示,与正常对照组相比,阳性对照组与10%松果菊苷含药血清组细胞的矿化结节数量增多,有极显著性差异(P<0.01)； 10%松果菊苷含药血清组的矿化结节与阳性对照组相比,有显著性差异(P<0.05)。8.松果菊苷诱导BMSCs成骨分化过程中BMP2表达的检测。与正常对照组相比,阳性对照组、松果菊苷组BMP2 mRNA和蛋白的表达升高,有极显著性差异(P<0.01)；与阳性对照组相比,松果菊苷组的BMP2 mRNA和蛋白的表达显著升高,有极显著性差异(P<0.0.01)。9.抑制剂Noggin对松果菊苷诱导BMSCs成骨分化过程中ALP的影响。按不同处理因素培养细胞7d后,ELISA检测细胞裂解上清液中ALP含量的变化,与正常照组比较,阳性对照组、松果菊苷组及抑制剂Noggin组的ALP含量明显升高,差异有显著性(P<0.05)。与阳性对照组相比,松果菊苷组的ALP含量明显增高,有极显著性差异(P<0.01),使用抑制剂Noggin后,ALP含量下降,有显著性差异(P<0.05)。10.松果菊苷诱导BMSCs成骨分化过程中Smadl/5/8表达的检测。与正常对照组相比,阳性对照组、松果菊苷组及抑制剂Noggin组的Smadl/5/8 mRNA和蛋白的表达升高,有极显著性差异(P<0.01)；与阳性对照组相比,松果菊苷组的Smadl/5/8 mRNA和蛋白的表达升高,有极显著性差异(P<0.01),抑制剂Noggin组的Smadl/5/8 mRNA和蛋白的表达降低,有极显著性差异(P<0.01)。11.松果菊苷诱导BMSCs成骨分化过程中ZHX。表达的检测。与正常对照组相比,阳性对照组、松果菊苷组及抑制剂Noggin组的ZHX3 mRNA和蛋白的表达升高,有极显著性差异(P<0.01)；与阳性对照组相比,松果菊苷组的ZHX3 mRNA和蛋白的表达升高,有极显著性差异(P<0.01),抑制剂Noggin组的ZHX3 mRNA和蛋白的表达降低,有极显著性差异(P<0.01)。12.松果菊苷诱导BMSCs成骨分化过程中Runx2表达的检测。与正常对照组相比,阳性对照组、松果菊苷组及抑制剂Noggin组的Runx2 mRNA和蛋白的表达升高,有极显著性差异(P<0.01)；与阳性对照组相比,松果菊苷组的Runx2 mRNA和蛋白的表达升高,有极显著性差异(P<0.01),抑制剂Noggin组的Runx2 mRNA和蛋白的表达降低,有极显著性差异(P<0.01)。13.松果菊苷诱导BMSCs成骨分化过程中OSX表达的检测。与正常对照组相比,阳性对照组、松果菊苷组及抑制剂Noggin组的OSX mRNA和蛋白的表达升高,有极显著性差异(P<0.01)；与阳性对照组相比,松果菊苷组的OSX mRNA和蛋白的表达升高,有极显著性差异(P<0.01),抑制剂Noggin组的OSX mRNA和蛋白的表达降低,有极显著性差异(P<0.01)。结 论：1.在一定浓度范围内的松果菊苷含药血清(5%、7.5%、10%、15%含药血清)可以促进BMSCs增殖,存在浓度依赖性。浓度过低(2.5%)或者浓度过高(20%)对BMSCs增殖无促进作用。2.松果菊苷含药血清能够使BMSCs的ALP、BGP、I型胶原的表达增多,促进矿化结节的形成,提示松果菊苷含药血清具有诱导BMSCs向成骨细胞分化的能力,其中10%松果菊苷含药血清的效果最佳。3.松果菊苷含药血清能显著促进BMSCs中BMP2、Smad1/5/8、ZHX3、Runx2和OSX mRNA和蛋白表达。提示松果菊苷可能通过BMP2-Smad-Runx2通路发挥成骨诱导作用。