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目的： 新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxia ischemic encephalopathy，HIE)，是由于围生期窒息缺氧所致新生儿缺氧缺血性脑损伤（hypoxia ischemic brain damage，HIBD）。近年研究发现神经元细胞骨架降解是导致缺氧缺血脑损伤的重要因素，细胞骨架受到Rho及其下游效应物Rho激酶（Rho-associated coiled-coil kinase，ROCK）系统调控。Rho/ROCK激活可使细胞骨架肌动蛋白（F-actin）重组、生长锥塌陷、促进细胞凋亡、抑制神经再生，如抑制其活性，可稳定细胞骨架、促进轴突生长、保护神经元。本研究拟以体外培养的新生大鼠神经元为研究对象，观察缺氧损伤后神经细胞RhoA、ROCK-I、ROCK-II蛋白表达情况以及神经元突起长度、神经元细胞骨架F-actin等指标，并且观察加用ROCK抑制剂法舒地尔（Fasudil）干预后上述指标的变化情况，以证实Rho/ROCK信号通路参与神经元缺氧损伤过程的假设，为临床上开发ROCK抑制剂治疗HIE提供重要的实验依据。 方法： 取新生1d SD大鼠，离体培养7d皮质神经元分为对照组（正常培养细胞）、缺氧组（缺氧后加入法舒地尔的溶剂DMSO）、法舒地尔组（缺氧后加入35μM法舒地尔），缺氧组及法舒地尔组在缺氧培养后给予相应药物干预，置于37℃5％CO2培养箱内继续培养12h，以抗βIII微管蛋白（Anti-βIII Tubulin）免疫荧光染色法测量各组神经元突起长度，以Western blot方法测定神经元RhoA、ROCK-I、ROCK-II蛋白表达量，以Anti-F-actin免疫荧光染色激光扫描共聚焦显微镜拍照观察细胞骨架F-actin的形态变化。实验结果采用SPSS16.0统计软件进行统计分析，数据用（-x+s）表示，采用单因素方差分析比较组间差异，P<0.05表示差别有统计学意义。 结果： 1.神经元培养及鉴定 神经元接种于培养板后，可见大而圆的神经细胞，4h后神经细胞大部分贴壁于用多聚赖氨酸包被的培养板中，2、3天后神经元胞体增大，胞质丰富，突起延长，培养7-9天，神经元突起进一步延长，形成密集的神经元细胞网络。使用神经元特异性Anti-βIII Tubulin进行神经元鉴定。 2.法舒地尔对缺氧神经元轴突的作用 培养7天的神经元缺氧后加入法舒地尔，复氧后用Anti-βIII Tubulin进行免疫荧光染色，荧光显微镜拍照后对各组神经元突起进行测量。对照组、缺氧组、法舒地尔组神经元轴突的长度（μm）分别为：68.631±10.053、18.080±4.025、43.400±4.819，差异有统计学意义（P<0.05）。缺氧组的神经元突起长度短于对照组（P>0.05），法舒地尔组的神经元突起长度长于缺氧组（P<0.05），但短于对照组（P<0.05）。提示，法舒地尔具有减轻缺氧引起的神经元轴突缩短的作用，但不能完全逆转缺氧损伤。 3.法舒地尔对Rho/ROCK蛋白表达的作用 以Western blot方法测定神经元缺氧后Rho/ROCK蛋白的表达，对照组、缺氧组、法舒地尔组对应的RhoA蛋白与内参蛋白灰度的比值分别为：0.253±0.010、0.727±0.036、0.358±0.018（P<0.05）；对照组、缺氧组、法舒地尔组对应的ROCK-I蛋白与内参蛋白灰度的比值分别为：0.461±0.095、0.493±0.129、0.483±0.086（P>0.05）；对照组、缺氧组、法舒地尔组对应的ROCK-II蛋白与内参蛋白灰度的比值分别为：0.646±0.032、 0.828±0.044、0.499±0.040（P<0.05）。可见，缺氧可引起RhoA和ROCK-II蛋白表达量的升高（P<0.05），但对ROCK-I蛋白的表达量却无明显作用（P>0.05）；法舒地尔作用后，与缺氧组对比RhoA和ROCK-II蛋白表达量降低（P<0.05），但是对于ROCK-I蛋白量的表达却无明显作用（P>0.05）。 4.法舒地尔对细胞骨架的作用 用Anti-F-actin免疫荧光染色，随后激光扫描共聚焦显微镜拍照观察细胞骨架F-actin的形态，正常神经元F-actin主要分布于细胞外周、轴突、树突，形成周边肌动蛋白丝带且细胞骨架结构完整，缺氧后肌动蛋白丝带消失，F-actin降解，细胞骨架结构破坏，胞质内应力纤维增多，轴突回缩，神经元特征丧失。缺氧后加入法舒地尔干预12h，可见细胞骨架F-actin较缺氧组有明显增多，可对抗缺氧对细胞骨架的分解作用，促进细胞骨架重组。 结论： Rho/ROCK信号通路激活与新生大鼠神经元缺氧损伤有关，法舒地尔通过抑制RhoA/ROCK-II信号通路作用于神经元，减轻缺氧引起的神经元轴突缩短，抑制细胞骨架F-actin降解，从而对新生大鼠缺氧损伤的神经元起保护作用。